UBCH 5c TR-FRET检测试剂盒--检测协议&示例结果

UbcH5c TR-FRET检测试剂盒是一种均匀、灵敏的TR-FRET（时间分辨荧光共振能量转移）检测试剂盒，旨在测量UbcH5b（泛素结合酶E2 D3）泛素化活性。该试剂盒使用生物素标记的泛素和铽标记的抗体识别His标记的UbcH5c蛋白，以完成TR-FRET配对。该试剂盒包含足够的纯化的UbcH5 c、纯化的UBE1、生物素泛素、抗His-Tb标记的供体、染料标记的受体和400个反应的测定缓冲液。

艾美捷UBCH 5c TR-FRET检测试剂盒：

货号: BPS-79901

检测试剂盒格式: TR-FRET

物种: 人类

需自备材料:

能够测量时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）的荧光微孔板阅读器

可调节的微量移液管和无菌吸头

轨道摇床

UniProt #UBE1: P22314; UBCH5c: P61077

储存/稳定性: 如果按照指示储存材料，该检测试剂盒从收到之日起最佳性能可维持长达6个月。

应用: 筛选抑制Ubch5c活性的分子，在药物发现高通量筛选（HTS）应用中。

运输温度: -80°C

禁忌: UbcH5c TR-FRET检测试剂盒与高达1%最终DMSO浓度兼容。我们建议在U2检测缓冲液中以不超过10% DMSO溶液准备抑制剂，并每个孔使用2 μl。

避免冻融循环。

检测协议：

所有样品和对照应进行三次重复实验。

检测应包括“空白”、“阳性对照”、“阴性对照”和“试验抑制剂”条件。

我们建议在实验过程中将稀释后的蛋白质保持在冰上。

有关蛋白质处理的详细信息，请参阅蛋白质常见问题解答（bpsbioscience.com）。

我们推荐使用Bay11-7821作为内部对照。如果不对控制抑制剂进行剂量反应曲线测试，我们建议按照下面验证数据中显示的IC50值的0.1倍、1倍和10倍来运行控制抑制剂。

在冰上解冻UBE1、UbcH5c、U2检测缓冲液、生物素-泛素和ATP。短暂离心管以回收全部内容物。

将UBE1用U2检测缓冲液稀释至20 ng/?l（每个孔1.5 ?l）。

将UbcH5c用U2检测缓冲液稀释至4 ng/?l（每个孔1.5 ?l）。

将生物素-泛素用U2检测缓冲液稀释5倍（每个孔1 ?l）。

准备主混合物如下（每个孔5.5 ?l）：N个孔 × （稀释后的UBE1 1.5 ?l + 稀释后的UbcH5c 1.5 ?l + 稀释后的生物素-泛素1 ?l + U2检测缓冲液1.5 ?l）。

向“阳性对照”、“阴性对照”和“试验抑制剂”孔中各加入5.5 ?l主混合物。

向“空白”孔中各加入5.5 ?l U2检测缓冲液。

准备试验抑制剂（每个孔2 ?l）：对于滴定，准备比期望最终浓度高10倍的连续稀释。反应的最终体积为20 ?l。

向每个指定为“试验抑制剂”孔中加入2微升的抑制剂稀释液。

向“阳性对照”、“阴性对照”和“空白”孔中各加入2微升的溶剂溶液。

将抗His标签的供体和染料标记的受体各稀释400倍，使用U2检测缓冲液（每孔10微升）。这将制成供体/受体混合液。

向每个孔中加入10微升的供体/受体混合液。 注意：在添加底物（ATP）之前，考虑在室温（RT）下进行30分钟的预孵育步骤。

通过向“空白”、“试验抑制剂”和“阳性对照”孔中各加入2.5微升4毫米ATP来启动反应。

向“阴性对照”孔中加入2.5微升U2检测缓冲液。

避免光照，并在室温下孵育反应30分钟，或进行长达1小时的动力学分析。

使用能够测量TR-FRET的微孔板阅读器读取荧光强度。

应从所有其他值中减去“空白”值。

UBCH 5c TR-FRET检测试剂盒示例结果：

图:Bay11-7821抑制了UbcH5c的活性。在Bay11-7822浓度增加的情况下测量了UbcH5的活性（Tocris#1744）。结果表示为相对于阳性对照的活性百分比（在没有抑制剂的情况下测量，设置为100%）。