QA-Bio-酶促碳水化合物释放试剂盒特异性说明

适当使用各种糖苷酶可以确定唾液酸化（仅使用神经氨酸酶）以及N-连接糖链（仅使用PNGase F）和O-连接糖链（使用神经氨酸酶、β-半乳糖苷酶、O-糖苷酶和β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶）的特定存在。另外，QA-Bio在DeGlycoMx试剂盒（KE-DGMX）中提供了一种20微升瓶中预混合的酶溶液。

艾美捷QA-Bio-酶促碳水化合物释放试剂盒包含以下每种酶20微升：

PNGase F（脑膜败血黄杆菌）

O-糖苷酶（肺炎链球菌）

神经氨酸酶（尿素杆菌）

β-半乳糖苷酶（肺炎链球菌）

β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（肺炎链球菌）

其他提供的试剂：

反应缓冲液

变性溶液

Triton X

牛血清白蛋白（对照）

QA-Bio-酶促碳水化合物释放试剂盒特异性：

酶促CarboRelease试剂盒将去除糖蛋白上的糖基，从糖蛋白中移除所有N-连接的寡糖和许多O-连接的寡糖。使用酶PNGase F去除N-连接（天冬酰胺连接的）。此外，所有丝氨酸或苏氨酸连接的（O-连接）Gal-(b1-3)-GalNAc-(a1)和所有唾液酸替代的Gal-(b1-3)-GalNAc-(a1)将使用神经氨酸酶和O-糖苷酶的组合去除。添加β-半乳糖苷酶和葡糖胺苷酶将有助于较大O-连接结构的去糖基化。

QA-Bio-酶促碳水化合物释放试剂盒容量：

协议中推荐的酶量足以在给定时间内去除大约100微克的平均糖蛋白的糖基。PNGase F裂解通常是限速反应，因为即使是在糖蛋白变性后，一些空间位阻的N-连接残基的去除也很慢。由于所有酶在反应条件下几天内都保持活性，如果延长孵化时间，可以去除更多的糖蛋白。相反，如果正在裂解的糖蛋白量远少于100微克，则无需使用推荐的酶量。这些酶可以稀释到1X反应缓冲液7中。它们在4°C稀释状态下保持稳定。

牛血清白蛋白对照蛋白：

牛血清白蛋白含有唾液酸化的N-和O-连接的寡糖13。

注意：市售的Fetuin制剂含有将最终降解蛋白质的蛋白酶。Fetuin对照已经经过90°C加热10分钟以灭活蛋白酶。Fetuin溶液可以储存在4°C。

变性协议：

在Eppendorf管中，将100微克或更少的糖蛋白溶解在30微升去离子水中。

添加10微升5X反应缓冲液7和2.5微升变性溶液。轻轻混合。

在100°C下加热5分钟。 注意：一些蛋白质可能在与SDS加热时沉淀。在这种情况下，省略热处理，添加酶后将孵化时间延长至24小时。

冷却至室温。添加2.5微升Triton X-100溶液。轻轻混合。 注意：未添加Triton X-100可能导致一些酶活性降低。

添加每种酶1微升。

在37°C下孵化3小时。

按选择的方法进行分析。

或者，可以单独或顺序添加酶，以确定糖蛋白上存在的糖链类型。

非变性协议：

在Eppendorf管中，将100微克或更少的糖蛋白溶解在35微升去离子水中。

添加10微升5X反应缓冲液7。

添加每种酶1微升。

在37°C下孵化24小时。

应使用变性协议进行去糖基化，以提供完全去糖基化蛋白的凝胶标准。然后，可以将原生蛋白的位置与此标准进行比较，以判断去糖基化的程度。

艾美捷科技是QA-Bio的中国代理商，为科研工作者提供优质的产品与服务。