文献解读-TopoGEN-猫眼草黄素作为潜在抗癌药物对拓扑异构酶I和II的抑制性评估

拓扑异构酶（topoisomerase）是一类在DNA复制、重组、转录和修复过程中起关键作用的酶。根据催化功能和氨基酸序列，人的拓扑异构酶主要分为两类：拓扑异构酶I（Topoisomerase I）和拓扑异构酶II（Topoisomerase II）。拓扑异构酶I通过切割DNA单链发挥作用，而拓扑异构酶II则切割DNA双链。这两种酶在癌症治疗中具有重要意义，因为它们在某些癌细胞中高表达，因此成为抗癌药物的重要靶点。然而，现有的拓扑异构酶抑制剂（如道诺霉素、米托蒽醌、替尼泊苷、依托泊苷、伊立替康和拓扑替康）虽然在临床上用于治疗癌症，但副作用严重，如心脏毒性、免疫系统抑制、震颤和发热等。因此，寻找毒性更小的新型拓扑异构酶抑制剂具有重要意义。

猫眼草黄素（Chrysosplenetin）是一种甲氧基黄酮类化合物，广泛存在于某些菊科植物中，如德国洋甘菊（Chamomilla recutita）和青蒿（Artemisia annua）。它具有多种生物活性，包括抗骨质疏松、抗酪氨酸酶和抗神经氨酸酶活性，以及抗菌和抗癌作用。特别是，它对乳腺癌细胞系（如MCF-7、MDA-MB-231和T47D）具有选择性抑制作用，而对正常非肿瘤细胞（如MRC-5和HUVEC）的毒性较小。”In vitro and in silico assessment of DNA interaction, topoisomerase I and II inhibition properties of （Chrysosplenetin）” 主要研究了天然黄酮类化合物猫眼草黄素与DNA的相互作用及其对拓扑异构酶I和II的抑制作用。

猫眼草黄素与拓扑异构酶I和拓扑异构酶II共价DNA复合物的结合（A、B）和相互作用（C、D）模式。猫眼草黄素以棒状图表示，拓扑异构酶的主链以带状图表示，DNA分子则根据原子的静电势以分子表面渲染，颜色渐变从红色到白色再到蓝色，其中红色代表最低的势能，蓝色代表最高的势能。

实验方法

材料与试剂：实验中使用了猫眼草黄素（从青蒿中提取，纯度>95%）、pBR322超螺旋质粒DNA、人拓扑异构酶I和II（均购自Topogen）、细胞培养基、MTS细胞增殖检测试剂盒等试剂。

细胞毒性实验：通过MTS法评估猫眼草黄素对MCF-7乳腺癌细胞系的细胞毒性。将细胞接种于96孔板中，加入不同浓度的猫眼草黄素孵育72小时后，测定细胞增殖情况。

DNA水解切割实验：使用琼脂糖凝胶电泳评估猫眼草黄素对pBR322超螺旋质粒DNA的水解切割作用。将DNA与不同浓度的猫眼草黄素孵育后，观察DNA形态的变化。

DNA保护实验：通过Fenton反应产生羟基自由基，评估猫眼草黄素对pBR322超螺旋质粒DNA的氧化损伤保护作用。将DNA与Fenton试剂及不同浓度的猫眼草黄素孵育后，观察DNA形态的变化。

拓扑异构酶抑制实验：使用琼脂糖凝胶电泳评估猫眼草黄素对拓扑异构酶I和II的抑制作用。将超螺旋pBR322质粒DNA与拓扑异构酶及不同浓度的猫眼草黄素孵育后，观察DNA形态的变化。

分子对接研究：使用AutoDockTools和MacroModel软件进行分子对接研究，评估猫眼草黄素与DNA及拓扑异构酶I和II的结合模式和亲和力。

实验结果

细胞毒性：猫眼草黄素对MCF-7细胞具有显著的细胞毒性，IC50值为0.29μM。这与先前的研究结果一致，表明猫眼草黄素对乳腺癌细胞具有显著的抑制作用。

DNA水解切割：在不同浓度的猫眼草黄素作用下，pBR322超螺旋质粒DNA的形态未发生变化，表明猫眼草黄素未引起DNA的水解切割。

DNA保护：猫眼草黄素以浓度依赖的方式显著保护了pBR322超螺旋质粒DNA免受Fenton反应产生的羟基自由基的损伤。这表明猫眼草黄素具有抗氧化和DNA保护作用。

拓扑异构酶抑制：猫眼草黄素对拓扑异构酶I和II均表现出显著的抑制作用。特别是在12.5-100μM浓度范围内，对拓扑异构酶II的抑制率达到了83-96%。这表明猫眼草黄素可能通过抑制拓扑异构酶的活性来发挥其抗癌作用。

分子对接研究：分子对接研究表明，猫眼草黄素能够通过插入或沟槽结合的方式与DNA结合，并通过与拓扑异构酶I和II的活性位点结合来抑制其活性。这些结果进一步支持了猫眼草黄素作为潜在抗癌药物的潜力。

猫眼草黄素对拓扑异构酶I的抑制作用。1:DNA对照；2: DNA + 1u拓扑异构酶；3-6:DNA + 1u拓扑异构酶I +黄铜矿素（12.5, 25, 50, 100 μm）。	猫眼草黄素对拓扑异构酶II的抑制作用。1:DNA对照；2: DNA + 1u拓扑异构酶；3-6:DNA + 1u拓扑异构酶II +黄铜矿素（12.5, 25, 50, 100 μm）。

Topogen品牌的人拓扑异构酶I和II在药物研发领域具有广泛的应用价值。它们不仅可用于筛选和评估新型抗癌药物的拓扑异构酶抑制活性，还可用于研究拓扑异构酶的结构与功能关系，以及探索新型抗癌药物的作用机制。此外，这些酶还可用于建立高效的药物筛选平台，加速抗癌药物的研发进程。