TopoGEN松弛的pHOT-1质粒DNA底物，测定DNA旋转酶超螺旋活性

松弛pHOT-1是一种适用于测定DNA旋转酶超螺旋活性的DNA质粒。它也可用于测定DNA连接数的变化，以评估插层。使用高纯度topo I弛豫反应制备质粒，然后对弛豫产物进行灭活和再纯化。TopoGEN随后验证每批的松弛状态，并验证底物可以被大肠杆菌DNA旋转酶和金黄色葡萄球菌DNA旋转酶超螺旋化。

这种质粒非常适合检测任何拓扑异构酶。pHOT-1相对较小（<3KB），非常适合展示中间态拓扑异构体。由于所有拓扑异构酶都表现出简并的DNA结合和切割序列，pHOT-1将有效地支持广泛的拓扑异构酶活性。超螺旋pHOT-1是pBR322的缩小衍生物，优化以获得更高的产量。对于希望评估人类拓扑异构酶I在单一序列上的切割的研究者，它还有一个额外的特性：我们包含了人类拓扑异构酶I的首选结合位点（由Westergaard及其同事描述的十六核苷酸序列，见Bonven等人，1985年），该序列源自四膜虫核糖体基因重复序列。这个构建作为拓扑异构酶I切割底物非常有用，因为在没有喜树碱的情况下，酶在十六核苷酸位点有效切割。这允许研究者严格评估新的潜在拓扑异构酶I抑制剂，因为单一背景切割是内置的对照；如果该剂刺激在包含十六核苷酸位点的片段的这个和/或任何其他序列的切割，明显的切割很容易被揭示出来。通常，很难在DNA上捕获拓扑异构酶I切割；必须使用更多的酶，因为切割复合物会消耗酶的化学计量。由于这个原因，分析DNA切割需要更高水平的酶。该片段可以从多克隆位点使用下面显示的位点分离出来（Maniatis克隆书中的协议），末端标记并用作切割底物。

艾美捷TopoGEN松弛的pHOT-1质粒DNA底物：

编号：TG2035

分类：DNA底物

标签：dna底物，pHOT1，松弛DNA底物，松弛pHOT1

存储缓冲液：所有DNA都存储在TE缓冲液（10 mM Tris-Cl（pH 7.5），1 MM EDTA）中，浓度如上右上角指定。

存储和运输条件：这些DNA应存储在4°C下。DNA在常温下运输（或可能与酶运输一起在干冰上运输）。

质量控制分析：

?使用A260/A280比率法光谱测定纯度。在最适Gyrase活性条件下孵育，未导致任何可检测的DNA转化为缺口或线性DNA形式。

?对于超螺旋和松弛的DNA底物，超过85%的DNA将呈超螺旋（形式I）DNA，其余为缺口开放环状（形式II）DNA。没有可检测的线性DNA形式。

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