TopoGEN金黄色葡萄球菌DNA旋转酶质量控制测试方案

DNA旋转酶是由金黄色葡萄球菌中的两个基因GyrA和GyrB编码的II型拓扑异构酶。DNA旋转酶是一种基本的拓扑异构酶，通过链断裂/重新连接和DNA缠绕的过程使DNA超螺旋化。作为一种II型酶，旋转酶在使松弛的质粒DNA底物负超螺旋化方面具有独特性。DNA旋转酶也是喹诺酮类抗菌剂的靶标，这些抗菌剂通过使酶转变为DNA损伤剂来发挥作用。TopoGEN提供来自革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌的纯化DNA旋转酶，用于药物开发和筛选测定的各个方面。该酶在解链和超螺旋化动力DNA（kDNA）方面非常活跃，但也会使松弛的质粒DNA负超螺旋化。金黄色葡萄球菌酶是一个GyrA2GyrB2的异源四聚体，作为带有His标签的亚基纯化，重新组装成活性酶。

储存和运输条件：

该酶应储存在-20°C，并在这种浓缩状态下至少稳定6个月。酶可以在首次解冻时分装，以最小化多次冻融循环造成的损害。

单位定义：

一个单位将在37°C下，在以下描述的条件下，在30分钟内使100 ng的质粒超螺旋化。DNA旋转酶也会像所有II型酶一样解链kDNA；然而，产物将是负超螺旋化的微型kDNA。

艾美捷TopoGEN金黄色葡萄球菌DNA旋转酶（TG2000GSA）质量控制测试：

1. DNA旋转酶亚基通过公司专有方法克隆、过表达并纯化。通过CB染色在SDS-PAGE上为每个亚基检测到单一带。通过在优化I型活性的条件下测试超螺旋DNA的松弛来评估拓扑异构酶I的交叉污染。在这些条件下，与超螺旋质粒DNA孵育2小时后，未检测到松弛产物。

2. 通过测试线性kDNA和线性质粒DNA的形成来进行核酸酶污染测试。在10 mM MgCl2存在下，对1 ?g的连环kDNA或超螺旋DNA进行孵育（37°C下4小时）。在这些条件下，未产生线性DNA或分解产物。

3. 根据SDS-PAGE，亚基纯度超过95%。没有另一个亚基的情况下，任一亚基都不活跃，且任一亚基都不显示核酸酶活性。这些数据表明，宿主（大肠杆菌）不对金黄色葡萄球菌gyrA或B的单个亚基的活性有所贡献。这一点通过使用特异性针对大肠杆菌的抗GyrA IgG的Western blotting探针得到了证实（数据未显示）。

测定条件：

TopoGEN提供用于测定金黄色葡萄球菌DNA旋转酶的三种缓冲液样品。缓冲液如下：

5X测定液（提供0.5 ml）包含以下溶质：

375 mM Tris-HCl（pH 7.5）

37.5 mM MgCl2

37.5 mM DTT

0.375 mg/ml BSA

150 mM KCl

10X ATP液：20 mM ATP（0.25 mL）。酶需要最终浓度为2.0 mM ATP。

5X钾谷氨酸液：2.5M（0.25 mL）。酶需要最终浓度为500 mM K-Glu。

*注：这些缓冲液提供给客户，以便为旋转酶测定建立工作对照。可能需要额外的缓冲液，建议客户按照上述配方进行补充。

所有缓冲液应储存在-20°C。

TopoGEN金黄色葡萄球菌DNA旋转酶文献参考：

1. Kato et al. (1990) Cell 63:393-404.

2. Peng, H., and Marians, K. (1999). DNA Topoisomerase Protocols Volume I; page 163

3. Wang, J. (1996) DNA Topoisomerases. Ann. Rev. Biochem 65:635-692

4. Levine et al., (1998) Biochem Biophys Acta 1400:29-43

5. Strahilevitz, J and Hooper, D. (2005) 49:1946-1956

艾美捷科技是TopoGEN的中国代理商，为科研工作者提供优质的产品与服务。