DNA旋转酶检测试剂盒的应用说明&测定过程

TopoGEN-DNA旋转酶检测试剂盒旨在快速、特异地检测DNA旋转酶。该试剂盒有助于II型拓扑异构酶（DNA Gyrase）的纯化和鉴定，并含有对具有或不具有超螺旋能力的II型酶进行常规检测所需的所有试剂。

艾美捷DNA旋转酶检测试剂盒：

SKU：TG1003

类别：Topo套件

标签：DNA旋转酶、EC DNA旋转酶和旋转酶测定

旋转酶测定试剂盒内容：

足够进行100次测定的动基体DNA [kDNA]

线性kDNA标记

经拓扑异构酶II处理的解链kDNA标记（topo II处理）

10X旋转酶测定缓冲液

旋转酶停止和装载缓冲液

详细说明书

DNA旋转酶测定试剂盒应用说明：

拓扑异构酶II或DNA旋转酶对kDNA的解链程度与酶的量和孵育时间成正比。为了筛选柱分离的分数以确定活性峰，最好使用短的（5分钟）孵育时间，这样只有最活跃的分数会完全解链kDNA。对于筛选柱分离的分数或其他需要进行许多反应的测定，最好设置一个包含所有试剂的主反应混合物，除了待测分数，然后将这个混合物分装到反应管中，再添加待测分数。

高浓度的盐会抑制拓扑异构酶；因此，待测分数对最终反应的贡献不应超过30 mM单价盐。如果离子浓度超过这个值，则应使用低盐缓冲液进行补偿。

最好包括一个完整的反应，缺少蛋白分数，但包含待测分数所在的缓冲液。如果蛋白分数中含有改变DNA电泳迁移率的试剂，可能需要在加载凝胶前对样本进行苯酚/氯仿处理和/或乙醇沉淀。

凝胶解读：

解链的DNA标记将是开放环状DNA（OC，2.5 KB单体，至少有一个缺口）和一些闭环状DNA（CC）DNA。kDNA通常包含缺口DNA单体；因此，OC和CC DNA都将被看到。相比之下，不应产生线性DNA，因为这意味着核酸酶污染。还要注意，可以使用kDNA测定旋转酶来识别稳定缺口或切割中间体的试剂（见上文链接）。

并发症

最严重的问题出现在被测定的提取物中有干扰蛋白或物质时。粗细胞提取物可能含有过量的DNA结合蛋白或正电荷蛋白，它们会粘附在DNA上并抑制酶的接触。此外，核酸酶污染物可能会降解或缺口kDNA底物，因此模糊结果。解决这个问题的一个好方法是通过硫酸铵沉淀后跟柱层析来清理粗提取物。此外，通过稀释提取物和/或添加tRNA载体（以竞争基本蛋白），有时可以最小化这些问题。

该试剂盒可以储存在4°C；然而，对于长期储存（超过1个月），我们建议将其放置在-20°C。尽量避免反复冷冻和解冻kDNA，因为这会加速网络的降解。

旋转酶测定基于两步过程

1. 动基体DNA（kDNA）的解链

2. 由此产生的解链单体kDNA种类的超螺旋化

DNA旋转酶测定过程：

反应产物是使用TopoGEN开发的一种新型凝胶系统来解析的，该系统允许极其快速和明确地检测旋转酶活性。包括适当的缓冲液、DNA底物和DNA标记。本试剂盒不包括纯化的旋转酶；但是，包括了解链和线性DNA标记，以便用户可以清晰、方便地识别提取物或分数中的产品（见上文链接）。kDNA测定可以检测刺激旋转酶切割DNA的毒物以及仅仅抑制催化活性的试剂。基于kDNA的旋转酶测定的优势在于，它快速且简单，允许从粗混合物或提取物中进行活性引导的抑制剂纯化。