Synaptic Systems：WB碱性磷酸酶检测方案

在标准的西方印迹（WB）方法中，蛋白质样品通过变性SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）根据它们的分子量进行分离，转移到膜上，并通过抗体的免疫检测进行分析。

碱性磷酸酶（AP）染色是一种累积检测系统。在显影过程中可以轻松观察到颜色沉淀，并且当达到所需的信号强度时可以停止染色反应。与增强化学发光（ECL）检测相比，AP染色的灵敏度较低，但不需要特殊的成像设备来观察检测结果。

重要提示：一些蛋白质需要特殊的要求才能良好分离（例如未煮沸的样品或特殊的凝胶系统）。请参阅各自数据表中关于西方印迹的备注部分。

艾美捷Synaptic Systems--WB--碱性磷酸酶检测材料和试剂：

1、Ponceau S染色溶液：5%乙酸，0.1% Ponceau S

2、5%脱脂牛奶在含有Tween 20的Tris缓冲盐水中（5%脱脂牛奶-TBST）：20 mM Tris-HCl，pH 7.5，150 mM NaCl，5%（w/v）脱脂奶粉，0.02%叠氮化钠，0.1% Tween 20

3、碱性磷酸酶的底物缓冲液：100 mM Tris-HCl，pH 9.5，100 mM NaCl，5 mM MgCl2

4、BCIP染色溶液：20 mg/ml在100%二甲基甲酰胺中

5、NBT染色溶液：50 mg/ml在70%二甲基甲酰胺中

6、完整的染色溶液：每10 ml底物缓冲液中含有80 ?l BCIP溶液和60 ?l NBT溶液。使用前短时间准备此溶液。

7、一抗

8、碱性磷酸酶（AP）偶联的二抗检测试剂

程序：

使用SDS-PAGE分离待检测的蛋白质样品和分子量标准，并通过电泳转印到硝酸纤维素膜上。按照您的SDS-PAGE和转印设备的制造商说明操作。

1、使用Ponceau S染色溶液在室温下染色数分钟，以检查转移效率。

2、用水冲洗膜以去除Ponceau S染色溶液，并在室温下在实验室摇床中用5%脱脂牛奶-TBST孵育30分钟。

3、在室温下在实验室摇床中用新鲜的5%脱脂牛奶-TBST含有适当稀释的一抗孵育至少2小时，或在4°C下过夜。

4、用5%脱脂牛奶-TBST冲洗3-4次，每次10分钟。

5、用新鲜的5%脱脂牛奶-TBST含有推荐的AP偶联二抗（例如抗小鼠IgG，抗兔IgG）在适当的稀释下至少孵育1小时。

6、用5%脱脂牛奶-TBST冲洗3次，每次10分钟。

7、用底物缓冲液冲洗并平衡5分钟。

8、更换新鲜的完整的染色溶液并显影15-30分钟。如果信号非常强或弱，可以适当缩短或延长时间。

9、用H2O冲洗3次以停止染色反应。

注：Synaptic Systems标准协议在SYSY实验室中产生了良好的结果，并且可以用作参考。然而，为了获得高的特异性信号和低的非特异性背景信号，必须单独确定合适的抗体浓度、孵育温度和孵育时间。

艾美捷科技是Synaptic Systems的中国代理商，为科研工作者提供优质的产品与服务。