Synaptic Systems：ICC染色-甲醛固定方案

这个协议适用于甲醛（FA）固定的细胞的免疫细胞化学分析。科学家们使用自制的FA固定液，通过在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中溶解对甲醛（PFA），或者他们使用含有不同量的甲醇以稳定化的现成FA固定液。在我们的标准ICC协议中，我们使用含有少量甲醇的现成FA溶液。最佳的固定时间可能因细胞类型、细胞室或抗体而异。过短或过长的固定时间可能导致细胞结构完整性差或抗原掩蔽。在我们的标准协议中，我们采用15分钟4% FA固定以获得良好的结果。然而，有些抗体需要更短/更温和的FA固定，甚至需要甲醇或丙酮固定，因为表位容易被FA交联掩蔽（请参阅备注部分以获取不同的固定协议）。

重要提示：一些蛋白质需要特殊的要求才能良好检测。请参阅各自数据表中关于ICC的备注部分。

艾美捷Synaptic Systems--ICC染色-甲醛固定的材料和试剂：

1、PBS：磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4

2、固定缓冲液：4% FA（或4% PFA）在PBS中，pH 7.4，4%蔗糖

3、封闭缓冲液：10%正常血清，0.1% Triton X-100在PBS中（建议使用二抗宿主物种的正常血清进行封闭）

4、孵育缓冲液：5%正常血清，0.1% Triton X-100在PBS中（可以省略Triton；建议使用二抗宿主物种的正常血清进行封闭）

5、封片介质

6、可选：DAPI核染色

程序：

1、用PBS简要冲洗细胞。

2、用固定缓冲液固定细胞15-20分钟。

3、用PBS冲洗三次，每次10分钟。

4、用封闭缓冲液孵育30分钟。

5、在孵育缓冲液中含有一抗（适当稀释，请参阅数据表）孵育2小时。

6、用PBS冲洗三次，每次10分钟。

7、在孵育缓冲液中含有二抗孵育1小时（最佳稀释必须通过实验确定）。可选：在二抗溶液中加入DAPI。使用二抗时避免强光以最小化荧光染料的光漂白。重要提示：当使用荧光素偶联的一抗时，可以省略这一步。在多重染色中，确保使用对您实验中使用的其他一抗宿主物种进行过交叉吸附的二抗。理想情况下，所有二抗应来自同一宿主物种。如果不是，请确保它们也已经对其他二抗的宿主物种的IgG进行了交叉吸附。这避免了二抗之间的交叉反应。

8、用PBS冲洗三次，每次10分钟。

9、封片并用显微镜观察。

注：Synaptic Systems标准协议在SYSY实验室中产生了良好的结果，并且可以用作参考。然而，为了获得高的特异性信号和低的非特异性背景信号，必须单独确定合适的抗体浓度、孵育温度和孵育时间。

艾美捷科技是Synaptic Systems的中国代理商，为科研工作者提供优质的产品与服务。