Life Diagnostics：骆驼血清淀粉样蛋白A酶联免疫吸附试验检测原理

血清淀粉样蛋白A（SAA）是一种≈12kD的阳性急性期蛋白，以杠杆形式表达并在血液中循环。它是包括骆驼科在内的许多物种炎症和疾病的有用生物标志物。1该检测方法可识别骆驼和羊驼血清中的SAA。与骆驼SAA的反应性尚未得到调查。

该检测使用两种不同的肽特异性骆驼SAA抗体；一种用于固相固定（微量滴定孔），另一种与辣根过氧化物酶（HRP）结合用于检测。将标准品和稀释样品与HRP缀合物一起在微量滴定孔中孵育一小时。这导致SAA分子夹在固定抗体和检测抗体之间。然后洗涤孔以去除未结合的HRP缀合物。加入TMB并孵育20分钟。如果SAA存在，则会出现蓝色。通过添加Stop溶液停止显色，将颜色变为黄色，并在450nm处测量吸光度。SAA的浓度与吸光度成正比，由标准曲线得出。

艾美捷Life Diagnostics试剂盒提供的材料：

包被血清淀粉样蛋白A（SAA）抗体的96孔板（12条8孔条）

辣根过氧化物酶（HRP）结合物，11毫升

血清淀粉样蛋白A（SAA）标准品（冻干）

20倍洗涤液；TBS50-20，50毫升

稀释液；CSD50-1，50毫升

四甲基联苯胺（TMB），TMB11-1，11毫升

终止液，SS11-1，11毫升

未提供但必需的材料：

移液器和吸头

蒸馏水或去离子水

聚丙烯或玻璃试管

涡旋混合器

水浴

吸水纸或纸巾

板式孵育器/振荡器

板式洗板机

能够测量450纳米吸光度的板式阅读器

曲线拟合软件

保存：

SAA库存应储存在-20℃或以下。试剂盒的剩余部分应储存在2-8°C的温度下，微量滴定板应保存在带干燥剂的密封袋中。套件自购买之日起六个月内保持稳定。

标准品准备：

按照瓶签上的说明重新溶解血清淀粉样蛋白A（SAA）标准品。使用前轻轻混合数次。标准品不需要加热处理。

标记7个聚丙烯试管为500、250、125、62.5、31.25、15.63和7.81 ng/ml。

在标记为500 ng/ml的试管中，根据SAA标准品瓶签上详细说明的量取适量的稀释液。然后加入指示体积的标准品并轻轻混合。这便提供了500 ng/ml的标准品。

在标记为250、125、62.5、31.25、15.63和7.81 ng/ml的试管中分别加入250 ?l的稀释液。

将250 ?l的500 ng/ml SAA标准品吸入标记为250 ng/ml的试管并混合。这便提供了250 ng/ml的SAA标准品。

类似地，通过两倍连续稀释准备其余的标准品。如果不打算立即使用剩余的标准品，应将其冷冻存储在-20°C或更低的温度下。

样品准备：

Life Diagnostics的研究表明，骆驼血清至少应稀释4倍。除非稀释50倍或更多，否则不应使用血浆。最佳稀释比例应由研究者确定。

检测程序：

将所需数量的8孔条固定在支架中。未使用的条应存放在重新密封的袋子里，并与干燥剂一起存放在2-8°C下以备将来使用。

向孔中加入100 ?l的标准品和样品（我们建议标准品和样品运行两次）。

向每个孔中加入100 ?l的HRP结合物。

在25°C下，以150转/分钟的速率在板式振荡器上孵育一小时。

使用板式洗板机（每孔400 ?l）用1x洗涤液洗孔5次。

将孔猛击在吸水纸或纸巾上以去除所有残留的液滴。

向每个孔中加入100 ?l的TMB。

在25°C下，以150转/分钟的速率在轨道式微孔板振荡器上孵育20分钟。

20分钟后，向每个孔中加入100 ?l的终止液以停止反应。

轻轻混合。确保所有蓝色变为黄色非常重要。

在5分钟内，使用板式阅读器读取450 nm处的吸光度。

典型标准曲线：

下图展示了一个典型的标准曲线，以450纳米处的吸光度作为Y轴，相对于X轴上的血清淀粉样蛋白A（SAA）浓度。这个曲线仅用于说明。

参考文献：

1. El-Deeb WM, Fouda TA and El-Bahr SM. Clinico-biochemicalinvestigation of paratuberculosis of dromedary camels in SaudiArabia: Proinflammatory cytokines, acute phase proteins andoxidative stress biomarkers. http://www.pvj.com.pk/in_press/13-534.pdf (2014)

Life Diagnostics 专注于研发和生产临床前研究以及动物医学诊断相关的ELISA试剂盒、纯化的生物标志物和抗体等产品。产品覆盖心血管疾病、急性期反应、免疫毒性和免疫学标志物等研究领域，主要应用于小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猪、猴和鸡等物种。艾美捷科技是Life Diagnostics的中国代理商，为科研工作者提供优质的产品与服务。