BMA Biomedicals钙颗粒蛋白B，MRP14，ELISA试剂盒测试原理

Peninsula Laboratories International, Inc.专门从事抗肽抗体和放射免疫分析领域，研究产品线包括为科研用户提供高品质的免疫学检测试剂，如 ELISA 试剂盒、放免试剂盒、免疫荧光试剂盒及抗体相关辅助试剂等。Peninsula Laboratories International (PLI)和BMA Biomedicals 已合并。BMA和PLI 分别专注于它们在免疫组织化学和免疫测定中的应用。

人类MRP8的分子量为11.0千道尔顿，而人类MRP14以13.3千道尔顿的形式存在，还有一种截短形式为12.9千道尔顿。Ca2+能够诱导形成如下形式的异质复合物：(MRP8)(MRP14)（简称MRP8/14）、(MRP8)2(MRP14)和(MRP8/14)2。MRP8和MRP14上各自有两个EF手型结构域。MRP14对钙的亲和力比MRP8高，而且C末端的EF2结构域的亲和力高于N末端的EF1。C末端结构域也主要决定了二聚体的特异性。EF2中的螺旋在钙离子结合时会发生大的构象变化，可能作为Ca2+诱导的构象变化的触发因素。MRP8/14的抗菌活性是由MRP14 C末端附近的多组氨酸序列通过螯合锌引起的，并且可以通过Zn2+逆转。两个亚基本身都没有显示出抗菌活性，这表明Ca2+诱导的二聚体化导致多组氨酸序列的暴露发生了变化。Ca2+诱导的花生四烯酸和多不饱和脂肪酸与MRP8/14的结合可以通过添加Zn2+或Cu2+来防止，这是通过影响钙依赖性脂肪酸结合口袋的构象来实现的。在MRP8和MRP14的摩尔浓度相等时，以及每个EF手型结构域的钙离子数量大于3时，发生最大的脂肪酸结合。

艾美捷BMA Biomedicals-钙颗粒蛋白B，MRP14，ELISA试剂盒（#S-1008）测试原理：

一步法非竞争性夹心酶联免疫吸附测定，试剂包含辣根过氧化物酶催化的四甲基联苯胺颜色反应，包括在多孔板阅读器中450/630nm处的反应停止和读数。

提供的试剂：

S-1008A：即用型预包被并稳定的微孔板 + 板盖（各1个）。

S-1008B：500纳克标准品，重组MRP14的稳定冻干制剂。

S-1008D*：检测缓冲液，3倍浓缩，轻微浑浊的蓝色溶液。

S-1008E：0.48%四甲基联苯胺，0.18% H?O?在乙醇/丙酮9:1中的溶液。需避光保存。

S-1008F*：TMB底物缓冲液（柠檬酸钾）。

S-1008R*：试剂混合物：两瓶1.1毫升（每瓶）的混合物，包含HRPO偶联的检测抗体，11倍浓缩。

*所有标有星号(*)的液体溶液都含有0.1%（体积/体积）的Kathon CG作为防腐剂。试剂盒在冷藏条件下至少稳定至标示的日期。

未提供的物料：停止溶液（1N硫酸）、用于稀释的塑料管；用于洗涤的等渗盐水、移液管、可重复吸取的移液管、8通道移液管（2个）、微孔板洗涤器和阅读器（450nm/630nm滤光片）。

计算方法：

由重复测定形成的，样本中的含量是通过微孔板计算软件（例如Softmax，Molecular Device）或手动借助标准曲线来计算的。如果样本稀释超出标准范围，应该用适当的稀释度重新进行测定。

测试程序：

向每个孔中加入100微升稀释后的试剂混合物（见上文）。如果您处理多列，使用可分配100微升的可重复吸取的移液管最为方便。 2a. 按照下文建议，向第1列和第2列的孔中分别加入50纳克/毫升（“50”）至0.2纳克/毫升（“0.2”）的标准品，每孔100微升。包括两个空白对照孔（如果是用重复样本工作的话），这两个孔各加入100微升的检测缓冲液。 2b. 向相应的孔中加入100微升适当稀释后的样本。

在湿润环境中室温下孵育90分钟。

用等渗盐水洗涤板子3次。用柔软的吸收纸拍干。此时稀释TMB底物溶液，准备好停止溶液和8通道移液管，以便及时停止颜色反应。

向每个孔中加入200微升稀释后的TMB底物溶液。在室温下孵育4分钟。在MRP14存在的地方会发生蓝色颜色反应。

通过向每个孔中加入100微升停止溶液来停止颜色反应。颜色从蓝色变为黄色。注意：停止溶液含有1N硫酸，具有腐蚀性并会导致烧伤。如果接触到眼睛，请立即用大量水冲洗并寻求医疗建议。

在大约15分钟内，如果可能的话，将参考波长设置为630纳米，读取450纳米处的吸光度。 建议的板子设置： 可以选择以下板子排列方式，其中St50至St0.2是从50纳克/毫升到0.2纳克/毫升的标准稀释液，如上所述。Sa-1至Sa-38是重复样本。Cont指的是已知MRP14含量的对照血清（试剂盒中不包含）。

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