高灵敏度和高特异性RT-qPCR探针主冻干物/RT-qPCR master mix

SCRIPT RT-qPCR探针Master冻干液设计用于在单管中方便地进行Z大灵敏度和特异性的RT-q聚合酶链式反应。该酶混合物基于具有增强的热稳定性的基因工程RT聚合酶，从而提高了特异性、更高的cDNA产量和对高度结构化的长cDNA片段的改进的效率。冻干物在一个试管中包含RTPCR所需的所有试剂（模板和引物除外），以确保用Z少的移液步骤快速简便地制备。优质的酶混合物、超纯的dNTP和优化的完全反应缓冲液确保了卓越的扩增结果。SCRIPT RT-qPCR ProbesMaster用于从单链RNA模板中扩增双链DNA。在RT步骤中，逆转录酶合成与RNA模板互补的单链DNA分子（cDNA）。在PCR步骤的第一个循环中，Taq DNA聚合酶合成与cDNA互补的DNA分子，从而产生双链DNA模板。在随后的循环中，DNA聚合酶以指数方式扩增这种双链DNA模板。在一步RT-qPCR中，在开始反应之前，将RT和PCR的所有组分混合在一个试管中，从而在不打开试管的情况下依次进行。当应用于分析来自多个RNA样本的单个靶标时，这提供了极大的便利，并将污染风险降至Z低。

艾美捷RT-qPCR探针主冻干物/RT-qPCR master mix（PCR-159S）：

SCRIPT RT-qPCR 探针主冻干粉：包含预装的SCRIPT逆转录酶、热启动聚合酶抗体+、dNTPs（去氧核苷酸三磷酸）、反应缓冲液、MgCl2和稳定剂的冻干粉。PCR级水。

处理：SCRIPT RT-qPCR 探针主冻干粉以PCR反应管条或96孔板的形式交付，预装有完整的qPCR主混合物，以干燥、室温下稳定的格式。这种冻干粉结合了高性能与使用的便利性和稳定性。无需进行冷冻、解冻或在冰上移液。剩余的少量移液步骤Z小化了错误或污染的风险。每个小瓶包含进行20 μl RT-qPCR检测所需的所有组分（除了引物和模板）。要执行检测，只需将小瓶用引物和RNA模板的混合物填充。

灵敏度：一般可以从10 pg至500 ng的polyA RNA或10 pg至1 μg的总RNA中检测到目标。即使是更少量的RNA，也可以通过使用高表达的转录本成功扩增。

RT-qPCR检测准备：

1. RNA/引物混合物的准备：将以下组分加入到无核酸酶的微管中，并通过轻轻上下移液进行混合：

2. 变性和引物退火（可选）：请注意：对于表现出高度二级结构的RNA靶标、自互补或交叉互补的引物以及新靶标的初始实验，特别推荐样本变性。对于许多标准的RNA和引物组合，即使省略热处理也不会对结果产生负面影响。将混合物在70°C下孵化5分钟，然后放置在室温下5分钟。

3. 分配主混合物：向每个含有冻干粉的管子或板孔分配20微升(?l)的RNA/引物混合物。

逆转录和热循环：将小瓶放入PCR循环仪中，并启动以下程序。

1) 建议进行10分钟的逆转录时间，以获得100至200碱基对(bp)之间的Z佳扩增子长度。更长的扩增子，达到500碱基对，可能需要延长孵化时间至15分钟。每增加100碱基对，增加3分钟。Z优温度取决于RNA的结构特征。对于具有高二级结构的难扩增模板，将温度提高到55°C。请注意，每个特定的RNA，应调整Z优的反应时间和温度。

2) 建议进行5分钟的初始变性时间，以灭活逆转录酶。

3) 退火温度取决于所使用的引物和DNA探针的熔解温度。

4) 延伸时间取决于扩增子的长度。建议对1,000碱基对的片段进行1分钟的时间。为了获得Z佳的特异性和扩增效果，可能需要对推荐的参数进行个别优化。请注意，每个特定的RNA/引物对，应调整Z优的反应时间和温度。