CUT&RUN丨CUT&RUN RNA m6A-Seq，操作时间少于1小时

N6-甲基腺苷（m6A）是真核生物RNA分子上Z常见和Z丰富的修饰。m6A修饰由甲基转移酶复合体METTL3催化，并通过m6A RNA去甲基化酶FTO和ALKBH5去除，这些酶以α-酮戊二酸（α-KG）和Fe2+依赖的方式催化m6A去甲基化。已知METTL3、FTO和ALKBH5在许多生物过程中发挥重要作用，包括发育、代谢和生育。m6A占所有RNA碱基甲基化的80%以上，存在于不同物种中。m6A主要分布在mRNA中，也出现在非编码RNA中，如tRNA、rRNA和snRNA。m6A在mRNA转录本中的相对丰度已被证明可以影响RNA代谢过程，如剪接、核输出、翻译能力和稳定性以及RNA转录。由于m6A RNA甲基化酶和去甲基化酶缺陷引起的m6A甲基化水平异常可能导致RNA功能障碍并引起疾病。例如，由于FTO突变患者中FTO活性增加，通过尚未定义的途径，目标mRNA中m6A水平异常低，有助于肥胖及相关疾病的发生。RNA上动态可逆的化学m6A修饰也可能作为具有深远生物学意义的新表观遗传标记。因此，更多有助于更好理解m6A RNA甲基化水平和分布的有用信息，可以促进疾病的诊断和治疗。

目前，有几种方法用于表观转录组范围的m6A定位。这些方法包括MeRIP-seq、PA-m6A-seq、miCLIP和m6A-CLIP。MeRIP-seq已被广泛使用，但无法实现m6A分析的高分辨率。PA-m6A-seq、miCLIP和m6A-CLIP提高了分析分辨率，但存在可重复性差和过程复杂的问题。特别是，这些方法耗时（>2天）且成本高。

为了解决这些问题，EpigenTek开发了一种新方法：CUT&RUN RNA m6A-Seq（在目标下切割并使用核酸酶回收用于m6A测序）。我们的创新方法结合了MeRIP和m6A-CLIP的优势，具有z快的程序，并将其整合到EpiNext? CUT&RUN RNA m6A-Seq试剂盒中。

艾美捷 EpiNext? CUT&RUN RNA m6A-Seq试剂盒（P-9016）特点：

1、高富集度：使用RNA切割酶混合液同时切割RNA，并在目标m6A含有序列的两端切割/移除任何RNA序列，而不会影响抗体占据的RNA区域。仅与抗m6A抗体结合的短RNA片段被生成。因此，可以可靠地识别真正的目标m6A富集区域，并实现高分辨率定位。

2、低输入量：未结合的RNA切割和免疫捕获在同一个管中进行，这使得目标m6A含有区域得到Z大程度的保护，同时Z小化样本损失，允许输入RNA低至500纳克。

3、Z小背景：在目标m6A含有序列的两端切割未结合的RNA序列，能够Z小化MeRIP/测序背景，允许数据分析时读取数少于1000万次。

4、快速、简化的程序：从RNA到cDNA库的程序少于6小时，且操作时间少于1小时。

5、高度方便：试剂盒包含CUT&RUN RNA m6A-Seq的每个步骤所需的所有组分，这些组分足以进行m6A含有RNA序列捕获和捕获的cDNA库制备，因此使CUT&RUN RNA m6A-Seq成为Z方便、可靠且结果一致的方法。

CUT&RUN RNA m6A-Seq试剂盒检测原理：

EpiNext? CUT&RUN RNA m6A-Seq试剂盒包含了从总RNA开始进行成功的m6A-Seq所需的所有必要试剂。在反应中，目标m6A含有区域两端的RNA序列被切割/移除，并且使用结合有m6A捕获抗体的珠子捕获目标m6A含有片段。然后，目标m6A含有的RNA片段被回收、释放、逆转录，并连接接头。连接后的第一条链cDNA被扩增，然后用作文库合成的模板。使用高保真PCR混合液进行文库cDNA的扩增和索引。然后使用结合珠子清理cDNA。试剂盒中还包括一个阴性对照非免疫IgG，可以用来展示试剂盒的效果，并在富集RNA定量或生物分析仪分析步骤中展示性能。

EpiNext?CUT&RUNRNA m6A-Seq试剂盒的工作流程。