Hypoxyprobe-Pimonidazole HCl--维持软骨下骨缺氧环境可减轻骨关节炎的进展

解析文章《Maintaining hypoxia environment of subchondral bone alleviates osteoarthritis progression》

作者：

Hao Zhang ^1,2,3 , Lipeng Wang ² , Jin Cui ^1,2 , Sicheng Wang ^2,4 , Yafei Han ² , Hongda Shao ⁵ ,Cheng Wang ⁵ , Yan Hu ^2,3 , Xiaoqun Li ^1,6 , Qirong Zhou ¹ , Jiawei Guo ^1,2 , Xinchen Zhuang ¹ ,Shihao Sheng ¹ , Tao Zhang ¹ , Dongyang Zhou ² , Jiao Chen ² , Fuxiao Wang ² , Qianmin Gao ² ,Yingying Jing ² *, Xiao Chen ^{1,3 *}, Jiacan Su ^{1,2,3 *}

链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37018403/

背景

骨关节炎（Osteoarthritis, OA）是一种严重影响老年患者生活质量的关节退行性疾病，其特点包括关节软骨退变、软骨下骨异常改建、骨赘形成和关节炎症。软骨下骨的改变与OA的发生和进展密切相关，但其具体机制尚不完全明确。本研究由上海大学转化医学研究院苏佳灿教授团队与长海医院创伤骨科陈晓团队合作，围绕软骨下骨低氧环境在OA进展中的作用展开深入研究。

方法

动物模型与基因编辑

实验动物：使用C57BL/6背景的Lcp1敲除小鼠建立前交叉韧带离断（ACLT）诱导的OA模型。通过删除Lcp1基因（编码L-plastin蛋白的基因）来抑制破骨细胞的形成。

基因编辑验证：通过PCR和qPCR验证Lcp1敲除的成功。

组织学与免疫组化分析

样本收集与处理：收集不同时间点的小鼠膝关节样本，进行固定、脱钙、包埋和切片。

染色方法：采用苏木精-伊红（H&E）染色、番红O/固绿染色、TRAP染色等方法评估软骨和软骨下骨的结构变化。

免疫组化：使用特异性抗体对L-plastin、HIF-1α、COL II、MMP13等蛋白进行定位与定量分析。

低氧探针检测

使用Hypoxyprobe品牌的HP6-100 Hypoxyprobe-1 Green Kit试剂盒：通过腹腔注射Pimonidazole HCl（缺氧探针）标记低氧细胞，然后用特异性抗体进行免疫荧光检测。

体内缺氧环境检测：使用18F-FMISO作为缺氧探针，通过PET/CT检测小鼠膝关节的低氧状态。

功能验证与药物干预

AAV介导的基因敲降：构建AAV载体表达针对Hif1a的shRNA，通过关节内注射验证HIF-1α在OA进展中的作用。

药物干预：使用DMOG（二甲基草酰甘氨酸）稳定HIF-1α，以及Oroxylin A（千层纸素）抑制破骨细胞形成，评估这些药物对OA进展的影响。

实验

软骨下骨与软骨的病理变化

通过H&E染色和番红O/固绿染色发现，OA进程中，野生型小鼠的软骨逐渐退变，软骨下骨体积减少，但在Lcp1敲除小鼠中，这些变化显著延缓。TRAP染色显示，Lcp1敲除小鼠中破骨细胞数量显著减少，软骨下骨吸收减少，软骨退变减轻。

低氧环境与HIF-1α的作用

使用18F-FMISO PET/CT和Pimonidazole HCl免疫荧光检测发现，OA早期软骨下骨低氧环境被破坏，HIF-1α水平下降。

在Lcp1敲除小鼠中，低氧环境得以维持，HIF-1α水平较高，软骨退变显著延缓。

HIF-1α的功能验证

通过AAV介导的基因敲降和DMOG药物干预进一步验证了HIF-1α在维持软骨稳态和防止OA进展中的关键作用。

敲降Hif1a基因后，Lcp1敲除小鼠的软骨保护效果被部分废除；而使用DMOG稳定HIF-1α则显著延缓了OA进展。

新药物的潜在应用

发现Oroxylin A作为L-plastin的特异性抑制剂，能够显著抑制破骨细胞形成，减轻OA进展，表现出良好的治疗潜力。

结论

本研究揭示了软骨下骨低氧环境在OA进展中的重要作用，并通过多种手段验证了HIF-1α在维持软骨稳态中的关键作用。通过Lcp1敲除和药物干预维持软骨下骨低氧环境，可以有效延缓OA进展。此外，本研究还发现Oroxylin A作为一种潜在的新药，具有治疗OA的前景。

Hypoxyprobe-1 Green Kit试剂盒的作用与价值：

作用

低氧检测：Hypoxyprobe-1 Green Kit试剂盒通过Pimonidazole HCl标记低氧细胞，使得研究人员能够在细胞和组织水平上直接检测低氧状态。这对于研究低氧环境下细胞的代谢和生存机制至关重要。

精准定位：该试剂盒提供的特异性抗体能够精准地定位到低氧区域，结合免疫荧光技术，可以在显微镜下直观地观察到低氧细胞的分布和数量变化。

量化分析：通过荧光强度的量化分析，可以评估不同处理条件下低氧状态的变化程度，为科学研究提供可靠的数据支持。

价值

科研工具：该试剂盒是生物医学研究中不可或缺的低氧检测工具，广泛应用于肿瘤、心血管疾病、神经退行性疾病等多个领域的研究中。

推动科学进步：通过精准检测低氧状态，科研人员能够更深入地理解疾病的发生和发展机制，为开发新的治疗方法和药物提供重要线索。

临床应用潜力：随着研究的深入，该试剂盒还有望在临床诊断中发挥重要作用，帮助医生更准确地评估患者的病情和预后。

综上所述，本研究不仅揭示了软骨下骨低氧环境在OA进展中的重要作用，还为OA的治疗提供了新的思路和方法。同时，Hypoxyprobe?-1 Green Kit试剂盒作为低氧检测的重要工具，在推动生物医学研究和临床应用中发挥了不可替代的作用。