PNA Bio-核酸酶报告：通过基因编辑事件来可视化和丰富细胞

大多数情况下，工程核酸酶的靶向效率在1%~30%之间。尽管与通过同源重组的传统基因靶向技术相比，这种效率相当明显，但分离携带所需突变的细胞的步骤仍然需要广泛的筛选。

PNA Bio开发的敲除细胞富集系统就是为了克服这些限制。使用替代报告子可以选择性富集在靶位点获得EN介导突变的细胞。

替代报告基因由编码通过EN靶向序列连接的两种荧光蛋白（红色和绿色）的基因组成。在没有EN表达的情况下，它们被设计为表达红色而不是绿色荧光蛋白，因为它被放置在框架外。ENs表达后，可诱导GFP前靶位点的双链断裂，导致移码突变和GFP表达。绿色GFP的表达严格依赖于特异性识别报告构建体中靶序列的ENs的核酸酶活性的存在。

PNA Bio的代理报告系统是一个很好的工具，可以通过基因编辑事件来可视化和丰富细胞。使用替代报告子系统，可以将发现敲除细胞的频率提高3～20倍。

艾美捷PNA Bio-替代报告系统：

GFP系统：mRFP（组成性表达）+ EN靶向位点 + GFP1（错位）+ GFP2（错位）

MACS系统：mRFP（组成性表达）+ EN靶向位点 + GFP（错位）+ 跨膜蛋白（错位）

HygR系统：mRFP（组成性表达）+ EN靶向位点 + GFP（错位）+ 潮霉素抗性基因（错位）

时间线：2周

左图：将不同量的Cas9蛋白与500ngsgRNA孵育。通过脂质体胺将RNP复合物转染到NIH3T3细胞中。24小时后，从每种条件下制备DNA用错配敏感核酸酶法（T7E1）检测Cas9蛋白和sgRNA的活性。

右图：对于体内成像，通过以下方法将500ng的Cas9蛋白和500ng的sgRNA转染到NIH3T3细胞lipofectamine。24小时后，通过共焦显微镜对细胞进行再成像显微镜。

Cy3-Cas9蛋白的活性通过电穿孔进入细胞，然后进行T7E1测定来确认。荧光通过共聚焦显微镜确认。

PNA Bio-Cas9共转染/选择载体：

CV02：Cas9、潮霉素抗性基因(Hygro R)和GFP（由CMV启动子驱动）

CV03：Cas9、红色荧光蛋白(RFP)和嘌呤霉素抗性基因(Puro R)（由CMV启动子驱动）

CV12：Cas9、潮霉素抗性基因(Hygro R)和GFP（由EF1a启动子驱动）

CV13：Cas9、红色荧光蛋白(RFP)和嘌呤霉素抗性基因(Puro R)（由EF1a启动子驱动）

文献参考：

1.Surrogate reporters for enrichment of cells withnuclease-induced mutations. KimH et al.  (2011) Nat Meth 8:941-943.

2.Magnetic separation and antibiotics selection enable enrichmentof cells with ZFN/TALEN-induced mutations. Kim H et al. (2013) PLosOne 8(2):e56476.

3.Surrogate reporter-basedenrichment of cells containing RNA-guided Cas9 nuclease-induced mutations. Ramakrishna S et al. (2014) Nat Comm 5: 3378

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