最强荧光——藻胆蛋白（PE, APC）

藻胆蛋白是源自微藻和蓝细菌的光合作用光捕获蛋白家族。这些蛋白质具有共价连接的线性四吡咯基团，称为藻胆素，其在捕获光能中起关键作用。在微藻和蓝细菌中，由这些藻胆素吸收的能量通过荧光共振能量转移（FRET）有效地转移到叶绿素色素用于光合作用反应。

与化学合成荧光染料相比，藻胆蛋白由于其相对高的荧光量子产率和消光系数而发出强烈的荧光信号。因为它们的荧光不被生物分子猝灭，所以藻胆蛋白可以在许多应用中用作有价值的荧光标签。与生物分子（例如免疫球蛋白，蛋白A或链霉抗生物素蛋白）缀合的藻胆蛋白已经在流式细胞术，荧光激活细胞分选（FACS），组织化学，成像和有限程度的活性氧物种检测中取得了巨大成功。目前市面上最主要两种类型的藻胆蛋白是的藻红蛋白（PE）和别藻蓝蛋白（APC）。

藻红蛋白（PE）

PE（2558）显示出非常明亮的黄橙色荧光，消光系数（ε）为1,960,000cm ^-1 M ^-1  ，量子产率（Φ）为0.84。相比于Cy3® （141） 的消光系数是150000 M ^-1 cm ^-1  和量子产率（Φ）为0.24的，PE荧光强度明显强很多。

藻红蛋白有两种形式，从红藻（RhodophytaI）中分离的R-藻红蛋白（R-PE）和从红毛菜目（Bangiales）中分离的B-藻红蛋白（B-PE）。B-PE和R-PE均由三种类型的亚基组成：α（~20 kDa），β（~20 kDa）和γ（~30 kDa）。虽然它们具有相似的亚基结构，但由于它们的亚基的发色团含量不同导致其吸收峰的相对强度产生差异。

R-PE和B-PE的吸光度和发射光谱的比较

别藻蓝蛋白（APC）

APC（2554）呈现明亮的红色荧光，消光系数为700,000 M ^-1 cm ^-1  ，量子产率（Φ）为0.68，相比于Cy5® （151）（消光系数ε=250000 M ^-1 cm ^-1，量子产率（Φ= 0.20），APC荧光亮度明显强很多。

APC的激发和发射光谱

R-PE，B-PE和APC荧光性能比较

与化学合成荧光染料相比，藻胆蛋白由于其相对高的荧光量子产率和消光系数而发出强烈的荧光信号。因为它们的荧光不会被生物分子猝灭，所以藻胆蛋白可以在许多应用发挥很大的作用。藻胆蛋白与生物分子（例如免疫球蛋白，蛋白A或链霉抗生物素蛋白）缀合，已经在流式细胞术，荧光激活细胞分选（FACS），免疫荧光成像和有限程度的活性氧物种检测中取得了巨大成功，目前市面上最主要的两种的藻胆蛋白是的藻红蛋白（PE）和别藻蓝蛋白（APC）。

ReadiUse PE和APC

使用PE或APC进行流式细胞时，首先必须将荧光蛋白与抗体缀合。然而，市售的藻胆蛋白浓缩在硫酸铵悬浮液中，虽然两者都表现出良好的长期稳定性，但在缀和前需要繁琐的纯化过程，例如透析，硫酸盐沉淀或凝胶过滤色谱，一旦纯化，PE和APC必须冷藏，不冷冻，并在一个月内使用，以获得最佳效果。

AAT Bioquest开发了一种冻干纯化藻胆蛋白的创新技术，我们的ReadiUse 藻胆蛋白系列是不含硫酸铵的冻干粉末，去除这种强沉淀剂消除了纯化过程，并促进PE或APC与抗体和其他蛋白质的快速缀合。以下是使用Buccutite 快速蛋白质标记试剂盒（1315）的ReadiUse PE（2500）的简要操作流程： 

1. 在H₂O中重构ReadiUse PE

2. 用Buccutite缀合激活PE和抗体

3. 混合活化的PE和活化的抗体

4. 使用脱盐柱纯化共轭物

比较不同储存温度对ReadiUse PE与ReadiUse APC的影响

在本研究中，将分别在各种不同条件下储存，随后，测试各种不同储存条件对冻干的ReadiUse PE（2500）和ReadiUse APC（2503）藻胆蛋白的性能的影响及与新鲜的市售的含有硫酸铵藻胆蛋白作比较。测试性能包括（对光谱特性，荧光量子产率和标记效率的比较），在测试之前，对市售的藻胆蛋白进行纯化以除去硫酸铵。

存储条件

将ReadiUse PE和ReadiUse APC等分到1mg小瓶中，并在四个不同温度下储存两个月。温度包括：

•       市售液体（Fresh）- 悬浮在硫酸铵中的新鲜纯化的藻胆蛋白（在当天制备）

•       L - 4 ^oC - 冻干粉末，ReadiUse PE和ReadiUse APC储存于2-8 ^oC

•       L - RT- 冻干粉末，ReadiUsePE和ReadiUse APC在室温下储存

•       L - （- 20 ^oC） - 冻干粉末，ReadiUse PE和ReadiUse APC储存在< - 15 ^oC

•       L -（- 65 ^oC）- 冻干粉末，ReadiUse PE和ReadiUse APC储存<-65 ^oC

不同储存温度对ReadiUse PE光谱特性的影响

我们在相同的条件和浓度下测量ReadiUse PE和市售新鲜纯化的PE的吸光度和发射光谱。下表数据表明，不同储存条件下ReadiUse PE光学特性非常稳定，在常温至-65^o C下条件下保存约2个月，在激发波长，发射波长和量子产率方面变化很小。

ReadiUse PE和市售含硫酸铵的PE的量子产率比较

不同储存温度对ReadiUse APC光谱特性的影响

在相同的条件和浓度下测量ReadiUse APC和新鲜纯化的APC的吸光度和发射光谱，下表数据表明，ReadiUse APC光学特性非常稳定，可在室温至-65 ^o C下保存约2个月，在激发，发射和量子产率方面变化很小。

表6.  ReadiUse APC和含硫酸铵的APC的量子产率

冻干ReadiUse PE和液体形式PE的标记效率

ReadiUse PE的标记效率是另一个需要检查的重要因素，因为它直接影响结合物的荧光产量。标记效率可以通过计算标记程度来确定，标记程度是缀合后染料与蛋白质（PE）的摩尔比，使用Cy5缀合反应检测ReadiUse PE 存储在不同的温度（4℃，RT，-20℃和-65℃，2个月）的反应性。市售新鲜制备的PE以相同方式与Cy5缀合，并用作阳性对照。

冻干的ReadiUse PE和新鲜PE标记效率的比较

冻干ReadiUse APC和液体形式APC的标记效率

使用Cy7缀合反应检测ReadiUse APC的标记效率。ReadiUse APC，存储在不同的温度（4℃，RT，-20℃和-65℃，2个月），新鲜制备的APC以相同方式与Cy7缀合，并用作阳性对照。

 冻干的ReadiUse APC和新鲜APC标记效率的比较

在HL-60细胞中检测了ReadiUse PE-Cy5串联和ReadiUse APC-Cy7串联的性能。使用Buccutite 快速蛋白质缀合试剂盒（1315）将ReadiUse PE-Cy5串联和ReadiUse APC-Cy7串联缀合至GXM IgG。随之使用Buccutite 缀合试剂盒用新鲜纯化的PE-Cy5和PE-Cy7串联制备缀合物，并用作阳性对照。结果表明，ReadiUse PE-Cy5和ReadiUse APC-Cy7缀合物在性能上与市售新鲜纯化的PE-Cy5和APC-Cy7缀合物相当。

结论：

AAT的ReadiUse PE和ReadiUse APC各方面性能与市售液体藻胆蛋白相当，我们的冻干藻胆蛋白在不同储存温度下均非常稳定（如RT，4℃和-20℃和-65℃），不会改变光谱特性，标记效率和性能。此外，ReadiUse PE和ReadiUse APC不含硫酸铵的粉末，不需要任何纯化（例如透析或脱盐），显著缩短了检测时间，提高了质量的一致性和重组浓度的灵活性，并且还减少了运输成本。

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