FabGennix-PDEase试剂盒，培养缓冲液的制备和检测设置

cAMP是一种普遍存在于所有哺乳动物细胞中的第二信使。这种信使调节各种激素、神经递质、生长因子、细胞因子和其他配体受体的信号转导。cAMP磷酸二酯酶是水解和截断源自受体激活的cAMP信号传导的唯一途径。cAMP水解活性由一个相当大的多酶家族提供，该家族具有独特的细胞内定位和调节特性。在各种PDE家族（PDE1-PDE11）中，PDE4有4个基因（PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D）以多剪接变体形式表达。

PDE4活性测量需要两步反应，在第一步反应中，cAMP被PDE活性水解成非环状。通过使PDE源变性或加入PDE4选择性抑制剂来停止该反应，然后通过第二步酶反应将AMP转化为腺苷达到平衡。由于腺苷是中性的，因此通过离子交换色谱法用电荷分离cAMP或AMP。为了避免其他PDE的背景贡献，该PDE测定在针对PDE4优化的底物浓度下进行。PDE4酶活性与第一反应中形成的腺苷成正比。

PDE4活性测量在2-3小时内提供可重复的结果。该试剂盒提供足够的试剂，与内部控制一起处理50或100个样本。试剂盒试剂在推荐条件下储存可稳定6个月。该试剂盒的内容物必须按照瓶子标签和规格表上的指示在不同温度下储存。

艾美捷FabGennix-PDEase试剂盒：

Incubation Buffer Reagent A   5 mL

Incubation Buffer Reagent B   5 mL

Incubation Buffer Reagent C   5 mL

PDE Substrate Buffer D10 mL

PDE Substrate   2X 200 ?l

Inhibitor Buffer   50 mL

Second Enzyme Source (10X)   2X 250 ?l

Resin Slurry (10X)   100 mL

Control PDE4 Enzyme   1x200 ?l

培养缓冲液的制备和检测设置：

1孵育缓冲液必须在使用前立即混合储备试剂来制备。

2将1.5毫升塑料圆锥管的成对排列放置在冰上，并使用锁扣盖密封。或者，可以使用16-18号针头刺一个小孔，用于在后续步骤中产生的蒸汽排放。

3在每个放置在4°C冰上的圆锥管中，用移液管取25微升由孵育缓冲液试剂A、B和C混合制备的孵育缓冲液（A:B为3:1，C为1，体积比）。使用前立即制备此缓冲液。

4将PDE酶在孵育缓冲液中稀释（步骤2中制备），以获得25微升孵育缓冲液中所需的PDE活性。通常细胞提取物中的25-50微克蛋白质。

5在4°C下向孵育缓冲液中加入25微升PDE酶。

6向上述一系列管中加入5-10微升PDE酶源（2.5-7.5微克蛋白质），并在4°C下孵育5分钟。应注意直接将酶滴入溶液中。所提供的部份纯化的PDE4酶可以按5-10微升/测定使用。

7用新鲜的孵育缓冲液补充至25微升。保持所有管在4°C。

8在PDE底物缓冲液D中制备适当浓度的抑制剂溶液，以获得25微升中所需浓度。可以添加高达5%的DMSO而不影响试剂盒性能。其他溶剂的效果应单独测试。

9通过添加25微升Rolipram（在PDE底物缓冲液D中为100微米）可以确定对Rolipram敏感的PDE4活性。

10可以通过用相同体积替代Rolipram来筛选未知化合物对PDE4的抑制作用。

11在没有任何抑制剂的情况下测量总PDE活性。抑制剂被25微升PDE底物缓冲液D替代，以测量总PDE活性。

12通过将100微升PDE底物与4885微升PDE底物缓冲液D和15微升2,8 3H-cAMP铵盐（乙醇溶液，25-40 Ci/mmol；杜邦NEN公司提供）混合，为每次测定新鲜制备cAMP缓冲底物，并保持在冰上。

13管子应标记为放射性，并应妥善处理放射性材料。

14将含有孵育缓冲液、酶源和抑制剂的圆锥管在30°C下预孵育5分钟。

15加入50微升缓冲PDE底物（步骤5中制备）。

16将底物直接移液到孵育介质中，并在30°C下摇动孵育10分钟。重要的是要计时添加底物，因为一旦添加底物，酶促反应就会开始。保存剩余的底物溶液以测量总3H-CMP计数。将剩余的作为液体放射性废物丢弃。

17在30°C下10分钟后，立即将管子转移到100°C水浴中3分钟，以停止PDE反应。管子可能因蒸汽产生而压力增大，为了避免盖子突然弹出，请提供适当的通风或使用带有点击锁定盖子的管子。

18立即将管子转移到冰上以冷却反应。此时可以停止测定，并将其存储在4°C下进行后续步骤。

将AMP转化为腺苷并与AMP和cAMP分离

1通过将缓冲酶的浓溶液与蒸馏水按1:10稀释来制备第二种酶溶液。保持在4°C。

2向每个管中加入25微升酶，并在30°C下孵育15分钟。丢弃未使用的部分，这种酶在稀释溶液中的活性不稳定。

3向每个管中加入400微升预活化的离子交换树脂。在移液过程中，树脂浆应该是均匀的；这可以通过使用小磁力搅拌棒不断搅拌来实现。

4盖紧并把所有管子涡旋30秒。

5将所有管子在冰上孵育15分钟。

6将所有管子离心13,000转/分钟2分钟。小心地转移150微升上清液进行3H β液体闪烁计数。保持闪烁液瓶在室温下至少2小时后再进行计数。将剩余的孵育混合物作为放射性废物丢弃。剩余的放射性将在树脂颗粒中。按照放射性处理剩余的管子，并将其作为固体放射性废物丢弃。

7取相同量的放射性PDE4底物进行总计数测量。

艾美捷科技是FabGennix的中国代理商，为科研工作者提供优质的产品与服务。