RT-qPCR master mix逆转录和热循环步骤

RT-qPCR master mix：用于双标记探针的冻干RT实时PCR Master Mix；分子生物学。

艾美捷RT-qPCR master mix（PCR-159S）含有SCRIPT逆转录酶、HotStart聚合酶Ab+、dNTP、反应缓冲液、MgCl2和稳定剂。PCR级水

RT-qPCR master mix检测准备：

1. RNA/引物混合液的准备

将以下组分加入到无核酸酶的微管中，并通过轻轻上下移液混合：

2. 变性和引物退火（可选）

请注意：特别推荐对展示高程度二级结构的RNA靶标、自身或相互补的引物以及新靶标的初次实验进行样品变性。对于许多标准的RNA和引物组合，可以省略热处理，而不会对结果产生负面影响。

将混合物在70°C下孵育5分钟，然后放置在室温下5分钟。

3. 分配主混合液

向每个含有冻干品的管子或板孔中分配20 ?l的RNA/引物混合液。

RT-qPCR master mix逆转录和热循环：

将小瓶放置在PCR循环仪中，并启动以下程序。

1) 建议进行10分钟的逆转录时间，以获得100至200个碱基对(bp)之间最佳扩增子长度。更长的扩增子，长达500个碱基对，可能需要延长孵育时间为15分钟。每增加100个碱基对，增加3分钟。最优温度取决于RNA的结构特征。对于具有高二级结构的难处理模板，将温度提高到55°C。请注意，应针对每种特定的RNA调整最优反应时间和温度。

2) 建议进行5分钟的初始变性时间，以灭活逆转录酶。

3) 退火温度取决于所使用的引物和DNA探针的熔解温度。

4) 延伸时间取决于扩增子的长度。对于1000个碱基对的片段，建议时间为1分钟。为了获得最佳特异性和扩增效果，可能需要对推荐的参数进行个别优化。请注意，应针对每种特定的RNA/引物对调整最优反应时间和温度。