【文献解读】BPS Bioscience，PARP1试剂盒，助力早期十二指肠癌的癌变轨迹研究！

小肠癌是一种恶性罕见癌症，其发病率约为0.6%，死亡率约为0.3% 。十二指肠癌是小肠癌中常见的类型（30% - 50%不等），主要包括腺癌、神经内分泌肿瘤、间质瘤、淋巴瘤等四种类型。近年来影像学发展迅速，总结出十二指肠病变的典型亚型，包括2个主要亚型（腺癌（D亚型）和Brunner’s腺（G亚型），其他亚型包括异位胰腺（P亚型）、肌间腺（N亚型）、淋巴管瘤（L亚型），囊性营养不良（C亚型），分化良好的神经内分泌肿瘤（NET亚型）。然而，这些复杂亚型的具体特征和风险因素的关联尚未被揭示。近期，复旦大学人类表型组研究院丁琛课题组联合复旦大学附属中山医院侯英勇团队以及上海交通大学赵健元团队在Nature communications在线发表了题为"Comprehensive Proteogenomic Characterization of Early Duodenal Cancer Reveals the Carcinogenesis Tracks of Different Subtypes"的文章，本研究首次揭示了早期十二指肠癌的蛋白基因组学图谱，通过时间解析模式探究十二指肠癌变过程中的关键事件，为探索十二指肠癌的亚型和分期的起源和蛋白基因组特征提供了新的认识。

艾美捷科技作为BPS Bioscience中国区代理，非常荣幸能够作为供应商为该项研究提供高品质PARP1活性分析试剂盒（80580），为生物医学领域的科研探索贡献一份力量。

引用产品：

该项研究中使用了艾美捷科技代理的BPS Bioscience的PARP1 Colorimetric Assay Kit，用于检测PARP1体外活性。

【实验技术，延伸解读】

① PARP1体外活性测定（PARP1 activity assay in vitro）

PARP1自体PARylation体外测定改编自一种已报道的方法121。简而言之，实验在40μl反应液中进行，含有50mM HEPES（pH=8.0）、4mM DTT、20mM MgCl2、25μl NAD+、200nM DNA和2μg PARP1蛋白。反应在30°C下进行30分钟。然后，收集反应液进行WB以检测聚（ADP-核糖）聚合酶水平。用于测量细胞提取物和体外反应中的PARP1活性的PARP1比色法试剂盒（BPS Bioscience, 美国, Cat# 80580）根据制造商的说明书使用。为了评估AARS1与PARP1相互作用减少PARP1活性，将纯化的AARS1加入反应液，并在试剂盒的样品制备步骤中与PARP1共同孵育30分钟在4°C下。

② 彗星实验（Comet assay）

彗星试验，推荐使用Comet试剂盒（Biogradetech，目录：D-AKE3040）检测培养细胞和组织中的单链和双链DNA断裂。在试验中，正常细胞中的荧光主要局限于细胞核，因为完整的DNA无法迁移。在DNA损伤的细胞中，DNA会被碱性或中性溶液变性以检测单/双链断裂，负电荷的DNA片段会从细胞核释放并向阳极迁移。

【产品解读】

PARP1 Colorimetric Assay Kit / PARP1活性分析试剂盒（80580）

PARP1比色法检测试剂盒旨在测量PARP1活性，用于筛选和分析应用。PARP1已知能催化NAD依赖性将多聚(ADP核糖)添加到组蛋白上。PARP1比色法检测试剂盒的关键在于生物素化的NAD+。使用该试剂盒，PARP1反应仅需要三个简单步骤。首先，组蛋白蛋白质被涂在96孔板上。接下来，生物素化的NAD+混合物（称为PARP底物混合物）与PARP1酶和活化的DNA模板在优化的检测缓冲液中孵育。最后，板子经streptavidin-HRP处理，随后加入比色的HRP底物产生颜色，可以使用UV/Vis分光光度计微孔板读数器测量。

产品组分：

实验步骤（简易汉化，请务必以英文原版说明书为准）：

步骤1：用96孔透明板包被组蛋白溶液

1.将5倍浓度的组蛋白混合物与PBS按1:5稀释，制备1倍浓度的组蛋白混合物。

2.向每个孔中加入50 μl组蛋白混合物，并在4°C下孵育过夜。

3.使用每孔200 μl PBST缓冲液（1倍PBS含0.05% Tween 20）洗涤板子三次。

4.轻拍板子以去除液体，使其沥干。

5.向每个孔中加入200 μl阻断缓冲液3，室温孵育至少90分钟。

6.使用每孔200 μl PBST缓冲液洗涤板子三次。

7.轻拍板子以去除液体。

步骤2：核糖基化反应

8.准备新鲜的10 mM DTT水溶液。

9.将激活的DNA按1:32稀释与PBS。

10.准备Master Mix（每孔25 ul）：N孔 x（2.5 μl 10倍PARP缓冲液 + 2.5 μl PARP底物混合物1 + 5 μl稀释的激活的DNA + 12.5 μl水 + 2.5 μl 10 mM新鲜的DTT）。

注意：Master Mix中DTT的浓度为1 mM。

11.向每个孔中加入25 μl Master Mix。

12.准备含DTT的1倍PARP缓冲液。通过添加1体积的10倍PARP测定缓冲液 + 1体积的10 mM DTT + 8体积的水将10倍PARP测定缓冲液稀释为含DTT的1倍PARP测定缓冲液。

注意：1倍PARP测定缓冲液中DTT的浓度为1 mM。

13.向标记为“Test Inhibitor”的每个孔中加入5 μl测试抑制剂。对于“Positive Control”和“Blank”，加入5 μl与稀释抑制剂相同的稀释剂溶液，但不加入抑制剂（稀释剂溶液）。

14.在冰上解冻PARP1酶。简短离心含有酶的管子，使其完全恢复管子中的全部内容。根据实验需要计算所需PARP1的量，并将酶稀释至0.33 ng/μl，使用含DTT的1倍PARP缓冲液稀释。PARP1的最终浓度将为1 nM。将剩余的未稀释PARP1酶分装并储存在-80°C。不要多次使用这些分装液。

注意：PARP1酶对冻结/解冻很敏感。避免多次冻结/解冻。不要再次使用稀释的酶。

15.向标记为“Positive Control”和“Test Inhibitor”的孔中加入20 μl稀释的PARP1酶，以启动反应。对于标记为“Blank”的孔，加入20 μl含DTT的1倍PARP缓冲液。室温孵育1小时。

16.使用200 μl PBST缓冲液洗涤板子三次，然后按上述方法轻拍板子。

步骤3：检测

17.在阻断缓冲液3中将Streptavidin-HRP按1:50稀释。

18.向每个孔中加入50 μl稀释的Streptavidin-HRP，室温孵育30分钟。

19.使用200 μl PBST缓冲液洗涤三次，然后按上述方法轻拍板子。

20.向每个孔中加入100 μl比色HRP底物，室温孵育，直到阳性对照孔出现蓝色。对于PARP1，通常需要15~20分钟才能完全显色。然而，合适的孵育时间可能因用户而异，应通过实验确定。

21.在蓝色显现后，向每个孔中加入100 μl 2 M硫酸，使用紫外/可见分光光度计微孔读数器在450 nm处读取吸光度。阴性对照-空白孔的吸光度应约为0.05。或者，可以在不加入2 M硫酸的情况下在650 nm处读取板子，但信号与背景比将降低。

结果展示：

在增加浓度的奥拉帕尼存在下PARP1活性的情况。奥拉帕尼（LC Labs，#O-9021）的效果使用PARP1比色法测定试剂盒（BPS Bioscience，#80580）按照试剂盒协议进行测量。使用Tecan UV/Vis分光光度计进行吸光度测量。

相关产品：

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#发表文章#

1. Li, Lingling et al. "Comprehensive proteogenomic characterization of early duodenal cancer reveals the carcinogenesis tracks of different subtypes". Nature communications vol. 14,1 (2023): 1751. doi:10.1038/s41467-023-37221-5

2. Syam, Yasmin M et al. "New Quinoxaline-Based Derivatives as PARP-1 Inhibitors: Design, Synthesis, Antiproliferative, and Computational Studies". Molecules (Basel, Switzerland) vol. 27,15 (2022): . doi:10.3390/molecules27154924

3. Li, Shuai et al. "Novel 4,5-dihydrospiro[benzo[c]azepine-1,1'-cyclohexan]-3(2H)-one derivatives as PARP-1 inhibitors: Design, synthesis and biological evaluation". Bioorganic chemistry vol. 111, (2021): 104840. doi:10.1016/j.bioorg.2021.104840

4. Yu, Jiang et al. "Design and synthesis of benzodiazepines as brain penetrating PARP-1 inhibitors". Journal of enzyme inhibition and medicinal chemistry vol. 37,1 (2022): 952-972. doi:10.1080/14756366.2022.2053524