这样做，快速高效地从细胞外基质中回收类器官细胞！

引言

当代水凝胶基质为2D和3D细胞培养提供了巨大的优势。它们提供了一个模拟天然组织的环境，提高了生长速度，并提供了可以可靠地测定天然体内细胞行为的条件。水凝胶基质的选择包括来自基于动物的细胞外基质（ECMs）的那些，如Matrigel和TheWell Biosciences无动物源的VitroGel 水凝胶。在任何一种情况下，一旦细胞被培养，通常需要从水凝胶基质中回收细胞或类器官用于后续研究。

从水凝胶中回收细胞或类器官需要专门的程序来确保活细胞的产量。然而，从基于动物的ECMs中回收的传统方法带来了额外的挑战，例如需要低温、冗长的程序、低细胞活力以及回收过程中使用的材料保质期有限。由于细胞或类器官回收的目标通常是为下游应用进行传代培养，因此克服这些挑战对于满足广泛的用户需求至关重要。TheWell Bioscience的VitroGel 类器官回收溶液可以满足这些需求，允许在室温下、无酶的回收程序，在中性pH下进行，仅需10-15分钟即可完成。该溶液及其优化的方案允许从3D培养和2D ECM涂层板中收获细胞。

在这项比较研究中，我们专注于使用我们的VitroGel 类器官回收溶液的新配方从Matrigel中收获类器官，并与我们原来的VitroGel 细胞回收溶液和另一种领先的类器官回收溶液进行测试。我们使用不同的方法进行这些比较，以评估三种选择的整体稳健性。我们的新溶液也兼容用于从2D Matrigel涂层板中收获干细胞，这使其成为用于3D和2D应用的基于动物的ECM解离的强大工具。

材料和方法

材料 

使用类器官和细胞来比较不同回收系统和实验条件的效率。采用小鼠肠类器官（MIOs）进行类器官回收试验，而采用人类iPSCs（诱导多能干细胞）进行2D细胞回收试验。Matrigel（Corning，类器官等级：356255）用于初始细胞/类器官培养。VitroGel 细胞回收溶液（TheWell Biosciences; SKU = MS03）、VitroGel 类器官回收溶液（TheWell Biosciences; SKU = MS04）、Solution RLR（公司SC）和Solution 3OHS（公司SA）用作培养后回收类器官或细胞的介质。

细胞培养

MIOs在24孔板的每个孔中以Matrigel圆顶（25 μL/圆顶）培养3天，每个孔1 mL培养基，然后回收。对于2D培养，人类iPSCs在6孔Matrigel涂层板中培养3天。在类器官或细胞回收之前，从每个板中移除培养基。

回收

对于MIOs，将1mL冷（4°C）VitroGel类器官回收溶液（MS04）或VitroGel细胞回收溶液（MS03）添加到24孔板的孔中，以重新悬浮类器官-Matrigel圆顶。再添加另外1 mL的MS04或MS03以清洗板子，并将溶液与管子结合。轻轻用移液管混合，转移到15 mL离心管中，然后在冰上或冰箱里冷却2-5分钟（MS04）或10分钟（MS03）以进行ECM解离。Solution MS03最初设计用于从VitroGel中收获细胞，并非为基于动物的ECM使用而设计。此时，比较了两种不同的搅拌方法。在方法1中，预期更适合扩展，类器官被轻轻用移液管上下5-10次以打破成小片段。在方法2中，预期更适合完整收获以用于下游分析，试管在没有使用移液管的情况下摇动2分钟以产生完整的类器官。在4°C下以100 x g离心3-5分钟以收集类器官。还比较了两种VitroGel回收溶液与两种其他领先的类器官回收溶液（RLR和3OHS）之间的回收特性。对于这些溶液，孵育时间为15分钟，在冰上，而不是上述条件。然后所有条件下收获的类器官都准备好进行分析或次级培养在Matrigel中。

对于iPSCs，在从2D Matrigel涂层6孔板中移除培养基后，向每个孔中添加2 mL的PBS溶液。然后在每个孔中添加1 mL的VitroGel类器官回收溶液。将板子在37 °C下孵育3-5分钟。然后在每个孔中添加1 mL的培养基，并将细胞悬浮液转移到15 mL离心管中。用额外的1 mL培养基两次洗涤板子，然后将所有的洗涤液结合到离心管中。在4°C下以100 x g离心3-5分钟，去除上清液，此时沉淀中的细胞准备好进行次级培养、分析或储存。

分析 

回收后的类器官和细胞在回收后0、1和2天以及在Matrigel次级培养期间进行成像，以评估完整性和整体形态水平。图像用于比较不同生物类型（类器官vs.细胞）、不同的回收溶液和回收过程中采用的不同技术的有效性的完整性回收，如上所述。

结果

首先，我们评估了类器官收集过程中物理搅拌类型对回收的类器官特征的影响。方法1，轻轻吹打，导致更分散的类器官，可以容易地分布到多个容器中，而方法2，离心管摇动，导致更聚集的类器官，可以容易地直接收获（图1）。这些特征在整个2天的分析期间持续存在（图1）。

图1. 使用VitroGel类器官回收溶液从Matrigel中回收类器官。使用了两种不同的物理回收方法。方法1（顶部序列）：使用移液器将类器官轻轻破碎成小片段用于传代培养/扩增。方法2（底部序列）：摇动含有回收溶液和类器官的离心管，不使用移液器以回收更完整的类器官。

接下来，我们比较了VitroGel类器官回收溶液（MS04）和VitroGel细胞回收溶液（MS03）的回收效率（图2）。在离心收集类器官后，MS04溶液中的Matrigel完全溶解，而对于MS03溶液，类器官顶部有少量软凝胶残留。虽然两种溶液都导致了健康的类器官扩增，并且可以随后收获或传代培养类器官，但较新的VitroGel类器官回收溶液（MS04）显示出比旧的VitroGel细胞回收溶液（MS03）更高的回收效率。

图2. VitroGel类器官回收溶液（顶部）与旧的VitroGel细胞回收溶液（底部）的比较。类器官在Matrigel中培养三天后收获。上图显示了两种细胞回收溶液的健康类器官扩增，但较新的VitroGel类器官回收溶液显示出更高的回收效率。

为了将VitroGel类器官回收溶液与市场上其他领先的回收溶液进行比较，我们必须改变孵育时间和温度，将前者从2分钟延长到15分钟，并将后者从室温降低到冰浴。VitroGel类器官回收溶液与RLR和3OHS溶液的比较回收特性如图3所示。虽然在VitroGel类器官回收溶液中孵育后所有原始Matrigel都溶解，但在RLR或3OHS中孵育后大部分凝胶仍然存在。此外，通过移液器从VitroGel类器官回收溶液中重悬证明是容易的，而从RLR或3OHS中重悬证明是困难的。因此，细胞回收率最好的是VitroGel类器官回收溶液，其次是RLR，然后是3OHS。从VitroGel类器官回收溶液中回收的类器官在回收后5天显示出比其他两种溶液更完整的形态（图3）。

图3. VitroGel类器官回收溶液（顶部）与其他类器官回收溶液的比较。Solution RLR来自Company SC，Solution 3OHS来自Company SA。回收技术的差异在正文中描述。与其他两种溶液不同，使用MS04溶液回收的类器官可以更容易地重悬在细胞培养基中，并且可以更容易地破碎成小片段用于传代培养。

最后，我们分析了使用新的VitroGel器官样本恢复溶液从2D Matrigel涂层培养板中收获细胞的有效性。通过显微镜成像，明显看到人类iPSCs可以在恢复液中孵育仅3分钟后就可以轻松从培养皿中解离出来（图4）。此外，这个程序导致了将细胞完全从微孔板表面去除，并在随后的3天重新在Matrigel中培养中呈现出强健的形态（图4）

图 4. 使用 VitroGel 类器官回收溶液从 2D Matrigel 涂层板中收获 iPSC。VitroGel 类器官回收溶液可用于从 Matrigel 中收获 iPSC 细胞。A）在添加 VitroGel 类器官回收溶液 3 分钟后，从 Matrigel 涂层板上分离的细胞的形态。B）细胞收获后 6 孔板表面的图像，显示所有细胞均从 Matrigel 涂层板上移除。C）重新接种到新的 Matrigel 涂层板上的细胞的形态（第 3 天）。

讨论

上述结果强调了 VitroGel 类器官回收溶液在基于动物的 ECM（Matrigel）中培养后有效回收类器官和细胞的几个优点。

首先，对于类器官，使用 VitroGel 类器官回收溶液时，在时间上有明显的节省，并且温度使用方便（即室温或以上）。

其次，可以使用这种溶液采用两种不同但简单的物理搅拌方法来产生可定制用于不同下游应用的类器官聚集形态。例如，使用 VitroGel 类器官回收溶液进行回收可以轻松地将类器官破碎成小片段用于后期扩增。

第三，使用 VitroGel 类器官回收溶液后，凝胶解离容易且明显。如果凝胶不解离，则很难通过移液器将其破碎成小片段。这是因为凝胶的粘度；移液器的剪切力不足以在高粘度混合物中破碎类器官。然而，VitroGel 类器官回收溶液避免了所有这些问题，并且比两种领先的比较器回收溶液更能够做到这一点。

最后，我们还展示了 VitroGel 类器官回收溶液的多功能性，因为它也可用于在 Matrigel 涂层板上培养后实现人类细胞的高效和轻松分离。因此，可以在不使用机械力的情况下实现 2D 干细胞收获的温和分离，为用户提供高细胞产量和高细胞活力。

总之，我们在这里进行的分析和比较表明，TheWell Bioscience 的 VitroGel 类器官回收溶液（MS04）是从基于动物的 ECM 中快速高效地回收类器官/细胞的优越解决方案。

链接到使用的产品

1. VitroGel 类器官回收溶液：MS04-100，MS04-500

2. VitroGel 细胞回收溶液：MS03-100

参考文献

Risbridger, P., Lawrence, M. G., & Taylor, R. A. (2020). PDX: Moving Beyond Drug Screening to Versatile Models for Research Discovery. Journal of the Endocrine Society 4(11). https://doi.org/10.1210/jendso/bvaa132

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