多重检测！GlycoSense糖链分谱试剂盒使用说明

GlycoSense?是一种使用双激光流式细胞仪检测糖蛋白上糖基化模式的多重检测方法。GlycoSense?阵列由结合到多重微球（珠子）上的凝集素组成，这些凝集素能够结合糖蛋白上的末端单糖，从而快速分析存在的糖特征。这种简化的“GlycoPrint”虽然不能提供完整的糖基化谱或结构信息，但能够检测到几个关键糖特征的变化。这个阵列中的微球已经被评估过，能够结合N-连接糖上的唾液酸、半乳糖和N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）。GlycoSense?珠子可以用633/640纳米激光激发，并可以在常规流式细胞仪的APC、APC-Cy7或FL4荧光通道上进行测量。GlycoSense?检测需要对糖蛋白或检测糖蛋白的试剂（如结合伴侣或Fab片段）进行直接标记，使用488纳米激发的荧光团（例如，Alexa Fluor? 488、DyLight? 488、FITC、SureLight? 488）。也可以直接检测（例如，GFP）标记的重组糖蛋白。不推荐使用完整的抗体进行糖蛋白的二次检测，因为抗体的糖基化可能会干扰检测。

艾美捷GlycoSense糖链分谱试剂盒（LTZ-GK0101-50UL）使用说明：

1. 在含有1 mg/mL牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲盐水（PBS/BSA）中准备一份标记或未标记的糖蛋白样品。样品中糖蛋白的浓度应介于0.5-5μM之间，以0.5-2μM为zui佳。（抗体浓度在0.5-1μM之间为zui佳。）也可以检测未知浓度的非糖蛋白，但如果超过5μM可能会导致背景信号过高。按照试剂盒中的方法，将标记的胎蛋白和去糖胎蛋白对照样品制备成1μM的浓度。检测体积可以是50-1000μL，对于大多数市售的流式细胞仪来说，100μL为zui佳体积。也可以使用其他缓冲液和无血清培养基进行GlycoSense?检测，但结果可能会有所不同。

2. 在使用前彻底振荡混匀珠子。向糖蛋白样品中加入1μL（约10,000个微球）的每种GlycoSense?珠子#。在避光的条件下，在室温下使用低速至中速旋转或振荡设备孵育1小时。胎蛋白和去糖胎蛋白对照样品直接用染料标记，不需要二次标记步骤。如果分析未标记的糖蛋白，在孵育后离心下来，去除上清液，并在避光的条件下与标记的二抗试剂（例如，100μL的1μM抗糖蛋白Fab片段）孵育30-60分钟。较长的孵育时间会导致信号增强，但背景也会增高。如果需要将两个或更多检测的结果进行直接比较，孵育时间应保持一致。（可选：为了减少背景和非特异性结合，在与染料标记的蛋白孵育后离心下来，去除上清液，并在PBS/BSA中重新悬浮珠子。）

3. 创建一个双变量前向和侧向散射（FSC/SSC）点图。将Gating Beads稀释至1:10的PBS/BSA中。在流式细胞仪上以慢速运行2-3分钟。门控整个微球总体群。稀释后的珠子可以丢弃或保存在4°C下以备将来使用。

4. 在散射门控的微球上创建一个红色荧光通道直方图（例如APC或FL4），以区分个别峰#。调整PMT设置以适应直方图中的所有峰，如有必要。在红色荧光直方图中门控个别峰#。为每个珠子峰#创建一个绿色荧光通道直方图（例如FITC或FL1）。

5. 完成步骤2中的结合孵育后，以慢速在流式细胞仪上运行样品。调整绿色通道的PMT设置，使zui高值在直方图的范围内，如有必要。收集至少1,000个事件对应于每个珠子#。

6.记录绿色通道中每个峰#的中位荧光强度，可以直接从流式细胞仪软件中读取，或使用数据分析程序。

GlycoSense 糖链分谱试剂盒数据分析：

在每个珠子#收集至少1,000个事件之后，可以直接从流式细胞仪软件中记录每个峰的中位FL1值，或者使用流式细胞数据分析程序获取，然后使用Excel等程序进行绘图。由于BSA珠子代表的是背景荧光，并且会依赖于样品（非特异性结合以及流式系统中的染料或荧光蛋白），所以可以从其他值中减去BSA珠子的读数。背景荧光在不同样品之间会有轻微的变化，因为蛋白质可能具有不同的荧光团与蛋白（F/P）比率。试剂盒中包含的胎蛋白和去糖胎蛋白的F/P比率是相似的。

下图展示了1μM SureLight? 488标记的胎蛋白和去糖胎蛋白与五种GlycoSense?珠子#结合1小时后的代表性“GlycoPrint”（Excel图表）。使用BD Accuri C6流式细胞仪记录了中位FL1荧光值。三个独立样品值的平均值被绘制成图，并以标准差作为误差条。数据表明胎蛋白上存在α2,6-和α2,3-连接的唾液酸，这是通过更高的SNA和MAL I信号显示出来的，而通过更高的ECA信号可以看出去糖胎蛋白具有更多的末端半乳糖。

图：SureLight?488标记的糖蛋白与GlycoSense?珠结合的比较

注：使用GlycoSense?观察到的荧光值是定性的。每种凝集素或捕获试剂对其特定聚糖靶标具有不同的亲和力，并且每个微球可能具有不同数量的偶联有效分子。GlycoSense?可以监测相关样品的聚糖特征变化或糖基化差异。