Jackson ImmunoResearch侧流免疫层析（试纸条）亲和纯化IgG方案

侧流免疫层析（lateral flow immunochromatography assay，LFIA；也简称为侧向层析）是一种基于抗原、抗体免疫反应的经典床旁检测技术（point of care testing，POCT）。侧流免疫层析试纸条，是一种在不使用实验室设备的情况下确认目标分析物是否存在的简易便携装置，作为是一种低成本、直接的方法，被广泛应用于检测人类和动物的感染或生物标志物，以及水、食物和动物饲料中的污染物和有害物质。

侧流免疫层析常见形式

侧流免疫层析的3种常见形式：直接法（图1）、夹心法（图2）和竞争法（图3）。每个测试都是以线性条带形式运行的，由分离和检测感兴趣的分析物所需的材料制成，并提供一个对照反应以确认测试的正确进行。下面的例子概述了侧流免疫层析的基本原理，并简要地强调了条带的组成部分和它们的功能。

关键试剂

抗体 - 亲和力和特异性

选择正确的抗体是开发成功的侧向流动免疫测定法的关键因素。

“如果没有认真测试筛选合适的抗体，那么再多的优化都无法克服这种固有的缺陷”（Brown，2008 年）

亲和力

亲和力特别重要，因为抗原的相对丰度可能很低。由于抗原、抗体偶联物和包被的抗体在测试条的分析区域中相互作用仅几秒钟，因此需要快速的 kon速率和慢的 koff速率。

特异性

抗体必须能特异性地识别目标抗原，而不能检测类似或同源的蛋白质和分子。由于在LFIA测试中使用了高浓度的抗体（通常比ELISA板孔中的抗体浓度高25-100倍），出色的特异性也是至关重要的。胶体金抗体偶联物通常以每次30-250ng的量被使用。如果假设样品在10-50ul内使标记的抗体再水化，那么抗体结合物的浓度将在0.6到20ug/ml之间。在较高的浓度下，抗体可能是其Kd的100倍，这可能会促使结合力弱、特异性低的抗体产生非特异性的相互作用，从而导致假阳性。

数量

首先要考虑的因素之一是启动和维持商业产品所需的数量。如果每条带 1ug 的捕获抗体并希望制作 100 万条，则所需的抗体量至少为 1g。因此，确保供应商能够以一致的质量生产大批量产品至关重要。如果要在内部制造抗体，则必须注意选择合适的抗原、免疫方法、筛选策略和放大工艺。

克隆性

单克隆抗体

单克隆抗体 (MAb) 的开发和生产是获得具有所需属性和保证质量稳定的抗体的有效方法。然而，在体外条件下的放大可能会很昂贵，并且在纯化运行之间可能会出现批次间的差异。筛选单克隆抗体以识别那些在膜结合、标记和与最终测定中使用的其他抗体一起表现良好的单克隆抗体也很重要。抗体在与膜结合时作为捕获剂工作良好，但在与报告分子结合时表现不佳的情况并不少见。最后，筛选还必须识别在实验条件下识别检测形式中表位的抗体，例如缓冲液成分或抗原的构象结构。

多克隆抗体

多克隆抗体 (PAb) 的生产很容易扩大规模，无论是使用兔子、山羊、鸡还是驴作为宿主动物。PAb 的另一个优点是它们也可用于实现更高的检测灵敏度。作为IgG的混合物，每种IgG同时和组合识别抗原上的不同表位，它们允许沉积更多的报告分子，从而增加信号。PAb 可能存在批次间差异，但由于它们是由宿主动物的免疫系统产生的，可能会随着时间而改变。

验证

无论来源或制造方法如何，都需要使用相应的工作流程来检验，以确保测试的一致性和可重复性。

对照线/质控线—抗体（Control Reagents）

虽然开发或选择合适的捕获和检测抗体对检测的性能至关重要，但在LFIA中使用的控制试剂的选择也很重要。与报告分子偶联的IgG或二抗通常被用来设置必要的对照线/质控线，以确保测试的正确可信。例如，阳性对照线可以用抗鸡的二级抗体，该抗体与偶联的鸡IgY结合。鸡IgY经常被使用，因为与哺乳动物IgG相比，鸡IgG的同源性和序列特征较低，因此产生的非特异性相互作用较少。对照线抗体也应该与LFIA中使用的其他抗体有最小的交叉反应，因为如果测试中使用的IgG或样品中存在的IgG干扰了对照试剂的结合，那么对照线的强度就会有很大的变化。

用于血清学测试的捕获抗体和检测抗体

血清学LFIA，使用抗体来捕获或检测由患者免疫反应产生的IgG。在血清学LFIAs中，检测线是涂有抗原的，而病人的样本中含有特定同型的抗原IgG，通过与病人血液中的IgG结合，而产生信号，该抗体与检测线上的抗原相结合（见图1）。检测抗体的特异性很关键，它不应该与检测中使用的其他物种的抗体或其他同种型的抗体结合。例如，在独立检测IgG和IgM同种型的检测中，抗IgG抗体不能与IgM发生交叉反应，而抗IgM抗体不能检测IgG。

报告分子与偶联物

常用于侧流免疫层析的报告分子包括胶体金、乳胶珠和荧光染料。每种选择都有明显的优势，选择取决于检测目标和检测读出方法。其他标签包括顺磁颗粒、酶、量子点、纤维素纳米珠、纳米金、二氧化硅纳米颗粒、生物发光和发光材料，以及上转换荧光剂（Goryacheva等，2013，Quesada-González & Merko?i，2015，和（Guo等，2021）

胶体金（Colloidal Gold）

胶体金是一种广泛用于LFIA的偶联物，因为它能产生强烈的颜色，易于偶联，并且它的质量稳定。典型的尺寸在40-80nm之间，其中40nm是最常见的。

金颗粒与抗体的结合通常是通过静电和疏水的相互作用被动进行的。这两个实体在低离子强度的缓冲液中混合，然后用多元醇或蛋白质如白蛋白或酪蛋白进行封闭。胶体金也有活化的表面，如羧基，允许在必要时进行共价连接。

乳胶微粒

乳胶颗粒用途广泛，自其最初开发以来一直被用于侧向流检测。颗粒可以装载彩色和/或荧光染料、顺磁颗粒和其他化学品。不同颜色的染料可以进行多种同时读出的检测。用于LFIA的标准尺寸范围为100-300um。缀合方法在吸附或共价连接之间变化，取决于表面化学。乳胶珠的敏感度可能低于胶体金，因为它们的大尺寸使它们不能密集地包装在测试或控制线上。

荧光染料

荧光染料作为标签得到了青睐；作为小分子（<1nm），它们比较大的纳米颗粒更容易从偶联垫中释放出来。染料有助于通过一个LFIA设备对多种分析物进行定量和检测（Wild，2016），尽管它们需要使用特殊的阅读设备来显示结果并充分利用染料的特性。适用于LFIAs的荧光团应该是经济的，具有长斯托克斯位移，良好的量子产率，并且是光稳定的。染料有多种形式，便于与蛋白质和小分子上的伯胺和巯基共价偶联。荧光素Fluorescein 和Cyanine染料是流行的选择。

一些染料可能不适合用于LFIA，因为在高浓度下会出现光漂白或淬灭。结合活性可能会因为发生在抗体副体或目标表位的关键点上的共价偶联而受到影响，或者因为疏水性染料引起的聚集。

以上，是艾美捷总结的一些关于侧流免疫层析（试纸条）亲和纯化IgG抗体的相关资料。