Jackson/艾美捷：如何使用偶联二抗进行多重标记？

多重标记，可同时检测多个靶标

多重标记是通过免疫荧光或比色 IHC/ICC 检测多种抗原的序贯免疫标记过程。成功检测出一种以上的抗原需要合理的实验设计，同时考虑到每个实验步骤积累的大量变量。在这里，Jackson详细介绍了如何设置多重标记实验以及执行成功检测所必需的一些注意事项。

设计多重标记实验

同时检测一种以上抗原的抗体的选择至少取决于两个重要标准：

1、无法识别的二抗的可用性：

彼此（来自相同的宿主物种），

测定系统中使用的其他一抗，

内源性免疫球蛋白存在于所研究的组织或细胞中。

2、使用分离良好的探针（酶反应产物、荧光团或电子致密粒子）。

（标有“ML”（多重标记）的亲和纯化抗体专为满足这些标准而制备。它们包括小鼠 IgG 亚类特异性抗体和针对其他物种交叉吸附 （min X） 的抗体。）

Jackson/艾美捷多重标签示例：

注意：在本例中，使用的二抗不会相互调和，因为它们都是在驴中制造的。它们已被固相吸附，因此它们无法识别步骤 2、5 和 8 中使用的其他一抗 （min X）。此外，它们不与内源性小鼠 Ig 发生反应，内源性小鼠 Ig 可能存在于小鼠组织中。

注意：不要用正常血清稀释任何抗体或将抗体混合在一起以节省时间，因为这可能会导致免疫复合物的形成和背景增加。

多标记协议生成器

此工具可能有助于设计您的实验。它将应用上述标准来确定一抗之间的潜在交叉反应性，从而确定每种二抗所需的最小交叉反应性。

输入样品种类和要使用的抗体。所有二抗最好使用相同的宿主物种，以尽量减少交叉反应的可能性。可以通过直接编辑表格中的文本来自定义抗原名称。

请注意，即使工具指示，也可能无法提供所有潜在的最小交叉反应性排列。山羊和驴通常是合适的二抗宿主物种选择，因为交叉反应性选择极少。

标记来自同一宿主物种的一抗

亲和纯化的二抗的单价 Fab 片段用于覆盖（阻断）免疫球蛋白表面，以双重标记来自同一宿主物种的一抗，或阻断组织切片或细胞表面的内源性免疫球蛋白。它们可用于这些目的，因为 Fab 片段只有一个抗原结合位点（即它们是单价的）。

标记与样品相同物种的一抗

有时可能需要使用与样品相同物种的一抗，例如Mouse on Mouse。在这些情况下，二抗也可能检测到内源性免疫球蛋白，从而引起不需要的背景。这可以通过Fab片段阻断来避免。

其他注意事项

阻塞

对于一般封闭目的，来自与二抗宿主相同的物种的正常血清 （5% v/v） 可有效降低非特异性、保守序列和/或 Fc 受体结合的背景。

抗体的特异性有害反应可以用二抗的单价Fab片段阻断。这种类型的封闭适用于标本和一抗属于同一物种的情况（例如小鼠标记上的小鼠），或者当在同一宿主动物中产生多种一抗时。

可视化

成功的多重标记取决于探头的使用，其信号可以通过可用设备进行区分。

荧光显微镜是多重标记的通用平台，因为滤光片组被设计用于区分许多可用的荧光团。窄带通发射滤光片对于从多个荧光基团分离信号、抑制重叠光谱中的荧光检测至关重要。在规划多标记方案时，应从荧光基团配制染料组合，该荧光基团具有与现有仪器兼容的发射光谱。

酶联抗体也可以实现多重标记。用一抗和二抗标记抗原位点，然后用显色底物（如 DAB、TMB 或 AEC）显色。其他抗原位点按顺序标记，每个抗原位点使用不同的显色剂。

对于电子显微镜中的多重标记，不同大小的胶体金颗粒与二抗复合，可以清晰地显示不同的抗原位点。

控制

在执行多重标记方案之前，优化每个一抗/二抗对的条件。滴定一抗和二抗将识别低背景和合适的阳性信号的情况。为了证明每种二抗对其预期一抗的特异性，请尝试用“错误”的二抗（阴性对照）标记一抗。

当使用在与标本物种相同的宿主中产生的一抗时（例如小鼠对小鼠），对照可用于确定非特异性信号的水平。

作为在中国的区域Jackson代理，艾美捷将为中国客户提供全面的Jackson产品以及客户订制化服务。