文献丨Hypoxyprobe Omni Kit试剂盒的实验探讨方案

在癌症研究中，非侵入性功能成像已成为评估肿瘤发展和治疗效果的重要工具。肿瘤缺氧与肿瘤的侵袭性和预后密切相关，是监测癌症进展的关键参数之一。近年来，光声（Photoacoustic, PA）成像技术因其能够结合高频率超声（Ultrasound, US）实现解剖学和功能性信息的并行收集，逐渐在临床前研究中展现出应用潜力。光声成像通过激光脉冲激发分子产生热弹性波，这些波可以被超声接收器检测，从而实现对深层组织内光吸收分子的高分辨率成像。

艾美捷Hypoxyprobe Omni Kit试剂盒（HP3）的应用：

在实验中，为了可视化缺氧区域，研究团队使用了Hypoxyprobe?-1 Omni试剂盒（Hypoxyprobe Inc.生产，货号：HP3）。该试剂盒包含Pimonidazole HCl和亲和纯化的兔抗Pimonidazole抗体（PAb2627AP）。Pimonidazole是一种乏氧细胞标记物，能够在缺氧条件下与细胞内蛋白质结合，形成稳定的加合物。通过腹腔注射Pimonidazole后，可以使用PAb2627AP抗体进行免疫组化染色，从而可视化组织中的缺氧区域。

解析文章《Real-Time Assessment of Tissue Hypoxia In Vivo with Combined Photoacoustics and High-Frequency Ultrasound》

作者：

Marco Gerling 1* , Ying Zhao 2,3* , Salvatore Nania 3 , K. Jessica Norberg 3 , Caroline S. Verbeke 4 , Benjamin Englert 1 , Raoul V. Kuiper 6 , ?sa Bergstr?m 1 , Moustapha Hassan 5 , Albrecht Neesse 7 , J. Matthias L?hr 1,3 , Rainer L. Heuchel 1,3 *

具体实验步骤：

肿瘤模型建立：研究团队使用了小鼠胰腺癌（KPC细胞系）和结肠癌（通过AOM和DSS诱导）模型。

成像与数据采集：使用VisualSonics Vevo 2100 LAZR成像系统对小鼠进行PA和B模式US成像。在PA成像中，采用750 nm和850 nm的双波长激光脉冲，测量氧合血红蛋白（HbO?）和脱氧血红蛋白（Hb）的浓度，进而计算组织氧饱和度（sO?）。在成像前，通过腹腔注射Pimonidazole，随后在成像后进行免疫组化分析，以验证PA成像结果的准确性。

免疫组化分析：切除肿瘤组织，用4%甲醛固定过夜，并进行石蜡包埋切片。

使用PAb2627AP抗体进行免疫组化染色，检测Pimonidazole与缺氧细胞内蛋白质的加合物。使用ImageJ软件量化棕色染色强度，以评估缺氧程度。

实验结果：

实时光声成像检测小鼠器官氧合度变化

通过改变小鼠的氧气供应，研究团队证明了PA系统能够实时检测组织氧合度的变化。当氧气供应从医用空气（21% O?）增加到纯氧（100% O?）时，PA成像显示肝脏实质和胃壁的氧合度均有所增加，且肝脏实质的氧合度增加更为迅速和显著。当氧气供应恢复到医用空气时，氧合度也随之恢复正常。

肿瘤缺氧检测及与组织学评估的相关性

在胰腺癌和结肠癌模型中，PA成像能够准确识别缺氧区域，并与免疫组化染色结果高度一致。例如，在胰腺癌模型中，PA成像能够清晰显示肿瘤内的缺氧区域，而免疫组化染色也证实了这些区域的缺氧状态。通过线性回归分析，研究团队发现PA测量的氧饱和度与Pimonidazole染色强度之间存在显著的正相关关系（r=0.91, p=0.0028）。

光声成像与静脉造影的互补性

为了评估肿瘤灌注情况，研究团队在PA成像的基础上结合了静脉造影。通过静脉注射微泡造影剂，并实时跟踪其在肿瘤内的分布和清除情况，研究团队能够同时获取肿瘤的氧合度、灌注情况和解剖结构信息。这种双模态成像方法为纵向实时监测肿瘤血管生成和治疗反应提供了有力的工具。

胰腺皮下肿瘤异种移植物肿瘤缺氧的评价。A)缺氧s.c肿瘤的典型氧-血红蛋白PA图像。b模式图像（左图）和氧饱和度图（氧- hemo PA成像，右图）并排放置，显示相同的成像窗口。热图表示氧饱和度水平，范围从100%（红色）到0%（深蓝色）。低于总Hb定义阈值（最大强度的20%）的斑点为黑色（见方法）。黄线代表肿瘤区域。B)同一s.c.肿瘤的代表性缺氧染色（棕色）。黑线表示肿瘤区域。C)图2A所示缺氧s.c肿瘤的代表性H&E染色。D)非缺氧性s.c肿瘤的典型氧血红蛋白图像。b模式图像和氧饱和度图

（氧合血红光声图像放置在右侧显示相同的成像窗口）。热图如上所示。黄线代表肿瘤区域。E)非缺氧s.c肿瘤的代表性吡莫硝唑染色，因此缺乏棕色染色，如图2D所示。黑线表示肿瘤区域。F)具有代表性的非缺氧性sc肿瘤的H&E染色。G)基于pa的so2测量和相应的吡硝唑染色强度线性回归分析的图形表示。将吡莫硝唑强度归一化，将数据集中的最高值调整为100，将最低强度设置为0。95%置信区间的置信带如图（虚线）所示。

结论：

本研究表明，双波长PA成像技术能够实时、可靠地检测小鼠肿瘤模型中的缺氧区域，并与免疫组化结果高度一致。通过结合B模式US和静脉造影技术，该方法还能够提供关于肿瘤灌注和解剖结构的详细信息。因此，双模态PA/US成像技术在临床前癌症研究中具有广泛的应用前景，可用于实时监测肿瘤生长和治疗反应。