Hypoxyprobe Gemini试剂盒的应用及检测说明

Hypoxyprobe? Gemini套件组件的详细描述

1) Hypoxyprobe?-1（皮莫尼达唑盐酸盐）和Hypoxyprobe?-F6（CCI-103F）是替代的2-硝基咪唑。皮莫尼达唑盐酸盐的分子量为290.8，水溶性高，为400毫摩尔相当于116毫克/毫升。CCI-103F是一种六氟化的2-硝基咪唑，具有六个磁等价的氟原子；分子量为337.2；水溶性为5.3毫摩尔相当于1.8毫克/毫升。CCI-103F通常以10%二甲基亚砜/花生油混合物的形式腹腔给药（Ljungkvist等人，《国际放射肿瘤学、生物学、物理学杂志》62(4): 1157-1168, 2005）。皮莫尼达唑盐酸盐和CCI103F在柔和光线下储存时都非常稳定。

皮莫尼达唑和CCI-103F在缺氧细胞中被还原激活。激活的中间体与蛋白质、肽和氨基酸中的硫醇（巯基）基团形成稳定的共价加合物。主要的抗皮莫尼达唑和抗CCI-103F抗血清以不交叉反应的方式结合到这些加合物，从而允许通过免疫化学手段进行检测。

2) 不交叉反应的兔抗血清，能够结合还原激活的皮莫尼达唑（PAb2627）和CCI-103F（PAbF6）的蛋白质加合物，作为稀释的抗血清供应，含有0.09%的叠氮化钠和1%的牛血清白蛋白作为稳定剂。感兴趣的组织可以通过免疫组化在福尔马林固定的石蜡包埋切片或冷冻固定切片上进行研究，或者在组织解离后通过流式细胞术进行研究，或者通过西方印迹。抗血清结合到缺氧细胞中皮莫尼达唑或CCI-103F的蛋白质、肽和氨基酸加合物，但免疫组化分析的组织处理会洗去肽和氨基酸加合物，因此免疫组化检测仅依赖于缺氧组织中皮莫尼达唑或CCI-103F的蛋白质加合物。

在连续的福尔马林固定的石蜡包埋组织切片上进行免疫过氧化物酶分析涉及将组织切片与大约1:500稀释度的抗皮莫尼达唑或抗CCI103F抗血清100微升孵化。然后应用显色剂山羊抗兔二抗以显示缺氧标记物加合物的分布。下面提供了一个详细的免疫过氧化物酶协议作为一般指南，但强调Hypoxyprobe?技术是稳健的，鼓励研究者自行修改。请参阅Ljungkvist等人，《国际放射肿瘤学、生物学、物理学杂志》62(4): 1157-1168, 2005及其中参考文献，以了解有关冷冻切片的研究。

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Hypoxyprobe Gemini试剂盒：

应用：使用Hypoxyprobe Gemini试剂盒通过免疫化学检测手段，包括免疫过氧化物酶、免疫荧光或流式细胞术，追踪单个组织样本中缺氧的纵向变化。Kleiter等人在连续切片上使用免疫过氧化物酶分析（Kleiter等人，《国际放射肿瘤学、生物学、物理学杂志》64(2): 592-602, 2006），而Ljungkvist等人（《国际放射肿瘤学、生物学、物理学杂志》62(4): 1157-1168, 2005）在同一组织切片上使用双重缺氧标记的免疫荧光分析。

数量：a. Hypoxyprobe? Gemini试剂盒分别包含100、200或1000毫克的缺氧标记物，即Hypoxyprobe?-1（皮莫尼达唑盐酸盐）和Hypoxyprobe?-6（CCI103F）。通常，在小动物研究中每个标记物的剂量为每公斤体重60毫克。

b. 每个试剂盒包含稀释的亲和纯化的抗皮莫尼达唑和稀释的抗CCI103F不交叉反应的兔抗血清（分别为PAb2627和PAbF6），含有0.09%的叠氮化钠和1%的牛血清白蛋白作为稳定剂。100毫克和200毫克试剂盒各包含一个200微升单位的抗血清；1000毫克试剂盒包含两个200微升单位的每种抗血清。抗血清的最佳工作稀释度应由研究者确定，但1/500 -1/1000稀释度与过氧化物酶结合的山羊抗兔二抗结合时可给出强烈的免疫过氧化物酶染色。对于双重标记免疫荧光研究，可能更适合使用1/50-1/200的较低稀释度（Ljungkvist等人，《国际放射肿瘤学、生物学、物理学杂志》62(4): 1157-1168, 2005）。

不提供：抗兔二抗试剂或其他免疫组化试剂（缓冲液、抗原检索剂等）。

储存：a. 将Hypoxyprobe?-1和Hypoxyprobe?-F6存放在室温下避光处（也可以存放在2-8摄氏度）。

b. 将兔抗血清（PAb2627 & PAbF6）存放在2-8摄氏度。

切勿冷冻。

检测说明：

在啮齿动物中进行双重标记研究，首先通过静脉输注或腹腔注射皮莫尼达唑盐酸盐的水溶液，剂量为每公斤体重60毫克（大约每只小鼠1.5毫克）。皮莫尼达唑盐酸盐在盐水中的溶解度为116毫克/毫升，因此可以使用非常小的体积。15至90分钟后，进行改变缺氧程度的干预。然后，以10%二甲基亚砜/90%花生油溶解的CCI-103F（请参阅Ljungkvist等人，《国际放射肿瘤学、生物学、物理学杂志》62(4): 1157-1168, 2005）以每公斤体重60毫克的剂量腹腔注射。60至120分钟后，收集感兴趣的组织。CCI-103F的剂量为每公斤体重60毫克，从摩尔基础上看比皮莫尼达唑盐酸盐少，但这被CCI-103F更长的血浆半衰期所补偿（CCI-103F的t1/2 = 90分钟，而小鼠中皮莫尼达唑为25分钟）。

注射后，Hypoxyprobe?标记物分布到所有组织，但只与含硫的蛋白质、肽和氨基酸形成加合物，这些细胞的氧气浓度低于14微摩尔——相当于37摄氏度下的部分压力pO2 = 10毫米汞柱。正常组织如肝脏、肾脏和皮肤拥有pO2为10毫米汞柱或更低的细胞，这些组织将结合Hypoxyprobe?标记物。在收获时组织中残留的Hypoxyprobe?标记物将在组织解离时被激活和结合。然而，与组织在典型实验期间暴露的量相比，残留的Hypoxyprobe?标记物浓度非常小，因此在组织收获时由于残留的Hypoxyprobe?标记物引起的任何非特异性结合都是不可检测的。

图表。Gemini套件用于比较在肿瘤携带犬的单次肿瘤活检中相邻组织切片口服给予的皮莫尼达唑（Pimo，左侧面板）和静脉给予的CCI103F（F6，右侧面板）。Gemini套件中对皮莫尼达唑和CCI-103F加合物不交叉反应的兔抗血清允许独立评估两个标记物的结合（Kleiter等人，《国际放射肿瘤学、生物学、物理学杂志》64(2): 592-602, 2006）。

Hypoxyprobe, Inc.（缺氧探针公司）专注于研发非侵略性的缺氧标志物（Hypoxia maker）和缺氧依赖性的细胞因子，所有产品皆基于Pimonidazole核心结构来开发。 使用Pimonidazole HCl作为缺氧标记物，广泛用在狗、大小鼠。缺氧探针试剂盒核心组分为：缺氧探针（Pimonidazole 或CCI-103F）和缺氧探针的抗体。不同试剂盒中的探针和抗体标记不同（可应用于免疫荧光（IF），免疫组化（IHC），WB或流式细胞分析（FC））

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