Hypoxyprobe-F6试剂盒：高效标记和检测缺氧区域，为疾病机制研究提供关键数据

Hypoxyprobe?-F6试剂盒组分的详细说明

1) Hypoxyprobe?-F6（CCI-103F）是一种六氟化2-硝基咪唑，具有六个磁等价的氟原子；分子量为337.2；水溶性为5.3毫摩尔，相当于1.8毫克/毫升。CCI-103F通常以10%二甲基亚砜/花生油混合物的形式腹腔注射（Ljungkvist等人，国际放射肿瘤学、生物学、物理学杂志。62(4): 1157-1168, 2005）。CCI-103F在昏暗光线下储存时非常稳定。

在缺氧细胞中，CCI-103F通过还原激活。激活的中间体与蛋白质、肽和氨基酸中的巯基（硫醇）基团形成稳定的共价加合物。初级抗CCI-103F抗血清与这些加合物结合，允许通过免疫化学方法检测它们。有关作用机制和关于Hypoxyprobe?标记物使用的常见问题（FAQ），请参阅www.hypoxyprobe.com。

2) 抗CCI-103F兔抗血清（PAbF6）与还原激活的CCI-103F的蛋白质加合物结合，并作为稀释的兔抗血清供应，含有0.09%的叠氮化钠和1%的牛血清白蛋白作为稳定剂。感兴趣的组织可以通过免疫组化在甲醛固定的石蜡包埋切片或冷冻固定切片上进行研究，通过组织解离后的流式细胞术，或通过西方印迹法进行研究。抗CCI-103F抗血清与CCI103F的蛋白质、肽和氨基酸加合物结合，但组织处理以准备免疫组化测定时会洗去肽和氨基酸加合物，因此免疫组化检测仅依赖于缺氧组织中CCI103F的蛋白质加合物。

在甲醛固定的石蜡包埋组织切片上进行免疫过氧化物酶分析，涉及将组织切片与大约1:500稀释的抗CCI-103F抗血清100微升孵育。然后应用显色剂山羊抗兔二抗以显示缺氧标记物加合物的分布。下面提供了一个详细的免疫过氧化物酶协议作为一般指南，但强调Hypoxyprobe?技术是稳健的，鼓励研究者自行修改。请参阅Ljungkvist等人，国际放射肿瘤学、生物学、物理学杂志。62(4): 1157-1168, 2005及其中引用的有关冷冻切片的研究。

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Hypoxyprobe-F6试剂盒：

应用：使用Hypoxyprobe?-F6试剂盒通过免疫化学检测方法，包括免疫过氧化物酶、免疫荧光或流式细胞术来测量组织和细胞中的缺氧情况。（Kleiter等人，国际放射肿瘤学、生物学、物理学杂志。64(2): 592-602, 2006。Ljungkvist等人，国际放射肿瘤学、生物学、物理学杂志。62(4): 1157-1168, 2005）。

数量：a. Hypoxyprobe?-F6试剂盒分别包含100、200或1000毫克的CCI-103F（Hypoxyprobe?-F6）。在小动物研究中通常使用的剂量是每公斤体重60毫克。

b. 每个试剂盒包含稀释后的抗CCI-103F兔抗血清（PAbF6），其中含有0.09%的叠氮化钠和1%的牛血清白蛋白作为稳定剂。100毫克和200毫克的试剂盒各含有一个200微升单位的抗血清；1000毫克的试剂盒含有两个200微升单位的抗血清。抗血清的最佳工作稀释度应由研究者确定，但1/200至1/500的稀释度在与过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗结合时能给出强烈的免疫过氧化物酶染色。

不提供：抗兔二抗试剂或其他免疫组化试剂（缓冲液、抗原修复剂等）。

储存：a. 将Hypoxyprobe?-F6储存在室温下的暗处（也可以储存在2-8摄氏度）。

b. 将兔抗血清（PAbF6）储存在2-8摄氏度。

测定说明

啮齿动物的标记物研究始于将CCI-103F溶解在10%二甲基亚砜/90%花生油中，通过静脉或腹腔注射（见Ljungkvist等人，国际放射肿瘤学、生物学、物理学杂志。62(4): 1157-1168, 2005），剂量为每公斤体重60毫克。60至120分钟后，收获感兴趣的组织。CCI-103F的剂量为每公斤体重60毫克，从摩尔基础上看比Hypoxyprobe公司提供的另一种缺氧标记物pimonidazole HCl的剂量要低，但这被CCI-103F更长的血浆半衰期所补偿（t1/2 = 90分钟，而小鼠中pimonidazole为25分钟）。

注射后，Hypoxyprobe?标记物分布到所有组织，但仅在氧气浓度低于14微摩尔的细胞中与含巯基的蛋白质、肽和氨基酸形成加合物——相当于在37°C时的氧分压pO2 = 10毫米汞柱。正常组织如肝脏、肾脏和皮肤拥有pO2为10毫米汞柱或更低的细胞，这些组织将结合Hypoxyprobe?标记物。在收获时组织中残留的未结合Hypoxyprobe?标记物将在组织缺氧时被激活并结合。然而，与典型实验过程中组织暴露的量相比，残留的Hypoxyprobe?标记物浓度非常小，因此在组织收获时任何由残留Hypoxyprobe?标记物引起的非特异性结合都是不可检测的。

图.相邻组织切片中CCI-103F结合（F6，右图）与吡莫硝唑结合（Pimo，左图）的比较来自福尔马林固定、石蜡包埋的犬肿瘤活检。免疫过氧化物酶数据显示，F6结合与那是吡莫硝唑。F6和吡莫硝唑加合物的兔抗血清没有交叉反应。这允许独立两种标记物结合的测量（参见Kleiter等人，Int.J.Radiation Oncol.Biol.Phys.64（2）:592-6022006）。

Hypoxyprobe, Inc.（缺氧探针公司）专注于研发非侵略性的缺氧标志物（Hypoxia maker）和缺氧依赖性的细胞因子，所有产品皆基于Pimonidazole核心结构来开发。 使用Pimonidazole HCl作为缺氧标记物，广泛用在狗、大小鼠。缺氧探针试剂盒核心组分为：缺氧探针（Pimonidazole 或CCI-103F）和缺氧探针的抗体。不同试剂盒中的探针和抗体标记不同（可应用于免疫荧光（IF），免疫组化（IHC），WB或流式细胞分析（FC））

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