Hypoxyprobe低氧探针Gemini试剂盒实验研究及文献参考

使用Hypoxyprobe Gemini试剂盒通过免疫化学检测（包括免疫过氧化物酶法、免疫荧光法或流式细胞术）跟踪单一组织样本中的缺氧变化。Kleiter等人使用免疫过氧化物酶分析对连续切片进行研究（Kleiter et al., Int. J. Radiation Oncol. Biol. Phys. 64: 592-602, 2006），而Ljungkvist等人则在同一组织切片上使用双重缺氧标记的免疫荧光分析（Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 62: 1157-1168, 2005）。

Hypoxyprobe低氧探针Gemini试剂盒检测说明：

双标记研究在啮齿动物中开始时，通过静脉输注或腹腔注射含有60毫克/公斤体重（约1.5毫克/只小鼠）盐酸匹莫苯溶液。盐酸匹莫苯在生理盐水中的溶解度为116毫克/毫升，因此可以使用非常小的体积。15至90分钟后，施加改变缺氧程度的干预。随后，腹腔注射溶解于10% DMSO/90%花生油中的CCI-103F（见Ljungkvist等，国际放射肿瘤生物物理杂志62: 1157-1168，2005），剂量为60毫克/公斤。注射后60至120分钟，收集目标组织。CCI-103F的60毫克/公斤剂量在摩尔基数上低于盐酸匹莫苯，但CCI-103F的血浆半衰期较长（t1/2 = 90分钟，盐酸匹莫苯在小鼠中的半衰期为25分钟），从而进行补偿。

注射后，Hypoxyprobe?标记物分布到所有组织，但仅在氧浓度低于14微摩尔的细胞中与含硫蛋白、肽和氨基酸形成加合物——相当于37°C下的分压pO2为10 mm Hg。正常组织如肝脏、肾脏和皮肤中的细胞氧分压在10 mm Hg或更低，这些组织会与Hypoxyprobe?标记物结合。在采样时未结合的Hypoxyprobe?标记物在组织中存在时，会在组织解剖时激活并结合，因为解剖后的组织会缺氧。然而，与组织在典型实验中暴露于的Hypoxyprobe?标记物量相比，残留的Hypoxyprobe?标记物浓度非常小，因此在组织采样时任何来自残留Hypoxyprobe?标记物的非特异性结合都是不可检测的。

图示：Gemini试剂盒用于比较口服给药的吡莫达唑（Pimo，左侧面板）和静脉给药的CCI-103F（F6，右侧面板），在来自肿瘤犬的单个肿瘤活检的相邻组织切片中进行分析。Gemini试剂盒中非交叉反应的兔抗血清可独立评估这两种标记物的结合（Kleiter等，国际放射肿瘤生物物理杂志64: 592-602，2006）。

建议的协议： 使用双重缺氧标记物对来自福尔马林固定石蜡包埋组织的相邻切片进行免疫过氧化物酶分析。Kleiter等，国际放射肿瘤生物物理杂志64: 592-602，2006。

艾美捷Hypoxyprobe-低氧探针Gemini试剂盒：

货号：HP5-XXX

规格：

a. Hypoxyprobe? Gemini试剂盒分别包含100、200或1000毫克的缺氧标记物Hypoxyprobe?-1（哌莫尼达唑HCl）和Hypoxyprobe?-6（CCI103F）。通常在小动物研究中使用每个标记物60毫克/千克体重的剂量。

b. 每个试剂盒包含稀释的亲和纯化抗哌莫尼达唑和稀释的抗CCI103F非交叉反应兔抗血清（PAb2627和PAbF6），其中含有0.09%氙化钠和1%BSA作为稳定剂。100和200毫克的试剂盒各包含一个200微升的抗血清单位；1000毫克的试剂盒包含两个200微升的抗血清单位。抗血清的最佳操作稀释度需由研究人员确定，但1/500-1/1000的稀释度在与过氧化物酶偶联的山羊抗兔次级抗体结合时能提供强的免疫过氧化物酶染色。1/50-1/200的较低稀释度可能更适合双重标记的免疫荧光研究（Ljungkvist et al., Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 62

: 1157-1168, 2005）。

未提供：抗兔次级试剂或其他免疫组织化学试剂（缓冲液、抗原修复剂等）。

储存：

a. 将Hypoxyprobe?-1和Hypoxyprobe?-F6在室温下避光存放（也可存放在2-8摄氏度）。

b. 将兔抗血清（PAb2627和PAbF6）存放在2-8摄氏度。

Hypoxyprobe?-F6试剂盒成分的详细描述：

1) Hypoxyprobe?-1（吡莫尼达唑盐酸盐）和Hypoxyprobe?-F6（CCI-103F）是取代的2-硝基咪唑类化合物。吡莫尼达唑盐酸盐的分子量为290.8，水溶性高达400毫摩尔，等于116毫克/毫升。CCI-103F是一种六氟化的2-硝基咪唑，具有六个磁性等效的氟原子，分子量为337.2，水溶性为5.3毫摩尔，等于1.8毫克/毫升。CCI-103F通常以10% DMSO/花生油混合物通过腹腔注射给药（Ljungkvist等，国际放射肿瘤生物物理杂志62: 1157-1168，2005）。吡莫尼达唑和CCI-103F在缺氧细胞中被还原激活，激活的中间体与蛋白质、肽和氨基酸中的巯基（硫醇）基团形成稳定的共价加合物。抗吡莫尼达唑和抗CCI-103F的初级抗血清以非交叉反应的方式结合这些加合物，从而允许通过免疫化学方法进行检测。

2) 非交叉反应的兔抗血清，能够结合还原激活的吡莫尼达唑（PAb2627）和CCI-103F（PAbF6）的蛋白加合物，作为稀释抗血清供应，含有0.09%的叠氮钠和1%的牛血清白蛋白作为稳定剂。感兴趣的组织可以通过免疫组化技术研究福尔马林固定的石蜡包埋切片或冷冻切片，或者在组织解离后通过流式细胞术，或通过西方印迹法进行研究。抗血清能够结合缺氧细胞中吡莫尼达唑或CCI-103F的蛋白、肽和氨基酸加合物，但免疫组化检测的组织处理会洗掉肽和氨基酸加合物，因此免疫组化检测仅依赖于缺氧组织中吡莫尼达唑或CCI-103F的蛋白加合物。对连续的福尔马林固定、石蜡包埋组织切片进行免疫过氧化物酶分析时，需将组织切片与约1:500稀释的抗吡莫尼达唑或抗CCI-103F抗血清混合孵育100微升。然后应用一种显色的山羊抗兔二级抗体，以揭示缺氧标记加合物的分布。以下提供详细的免疫过氧化物酶协议作为一般指南，但强调Hypoxyprobe?技术稳健，鼓励研究人员自行进行修改。有关冷冻切片研究，请参见Ljungkvist等，国际放射肿瘤生物物理杂志62: 1157-1168，2005及相关参考文献。

Hypoxyprobe 致力于为氧代谢紊乱引起的恶性和正常组织疾病提供诊断和治疗工具。

艾美捷科技是Hypoxyprobe的中国代理商，为科研工作者提供优质的产品与服务。