Hypoxyprobe/艾美捷Hypoxyprobe-1 Plus Kit的应用及检测步骤

Hypoxyprobe-1是一种取代的2-硝基咪唑，其化学名称为吡默尼达唑盐酸盐，分子量为290.8；水溶性为400毫摩尔（116 mg/ml）；在324 nm波长处的紫外吸收（0.9%生理盐水中消光系数为7020）。游离碱基吡默尼达唑的分子量为254.3，pKa为8.7，辛醇-水分配系数为8.5。

固体Hypoxyprobe-1在柔和光照下室温保存了两年，并在4°C的0.9%生理盐水（100 g/l）中保存了4.5年，没有检测到降解（紫外线和HPLC分析）。

吡默尼达唑在缺氧细胞中被还原活化，并与蛋白质、肽和氨基酸中的硫醇（巯基）基团形成稳定的加合物。FITC-MAb1与这些加合物结合，从而实现免疫化学检测。

FITC-MAb1是一种荧光素标记的抗吡默尼达唑大鼠IgG1单克隆抗体（MAb克隆11.23.22.R），浓度为0.5 mg/ml，溶于含有0.09%稳定剂proclin的PBS中。感兴趣的组织可以通过在冷冻固定切片或福尔马林固定的石蜡包埋切片上进行免疫组化，或通过组织解离后的流式细胞术进行研究。

注意：FITC-MAb1与吡默尼达唑的蛋白质、肽和氨基酸加合物结合，但在免疫组化过程中，组织处理会洗去肽和氨基酸加合物，因此免疫组化缺氧检测依赖于缺氧组织中吡默尼达唑的蛋白质加合物。

染色的抗FITC二级试剂是一种亲和纯化的兔IgG多克隆抗体，与辣根过氧化物酶结合，专为Hypoxyprobe, Inc.制备。过氧化物酶标记的抗FITC二级试剂在福尔马林固定、石蜡包埋的大鼠肿瘤组织中提供强烈的免疫染色，并且背景信号非常低。

艾美捷Hypoxyprobe-Hypoxyprobe-1 Plus Kit（HP2-XXX）：

应用：用于细胞和组织缺氧的免疫化学检测，包括免疫荧光、免疫过氧化物酶法或流式细胞术。当将Hypoxyprobe-1 Plus Kit与抗FITC二级试剂结合使用时，来自大鼠组织的天然绿色荧光蛋白（通常会干扰缺氧信号）产生的背景信号非常低。

数量：

a. 三种不同规格的Hypoxyprobe-1 Plus Kit分别含有100 mg、200 mg或1000 mg的吡默尼达唑盐酸盐。每千克体重60 mg的剂量足以用于动物研究。

b. 三种不同规格的Hypoxyprobe-1 Plus Kit还包含一个瓶（100 mg和200 mg Kit）或两个瓶（1000 mg Kit），每瓶含有200微升抗吡默尼达唑的FITC标记的IgG1大鼠单克隆抗体（克隆11.23.22.R）。每瓶含有200微升浓度为0.50 mg/ml的FITC-MAb1溶液，溶于含有1% BSA和0.09%叠氮化钠的PBS中。FITC-MAb1的最佳稀释度由研究人员确定，但在与1:50-100稀释的过氧化物酶标记的抗FITC二级试剂结合使用时，1:50-100的稀释度在大鼠肿瘤组织中能够产生强烈的免疫染色。虽然FITC-MAb1并非专为免疫荧光设计，但也可用于此目的。通常，免疫荧光的抗体稀释度低于免疫过氧化物酶检测的稀释度。

不提供：用于免疫组织化学分析的标准试剂。

储存：

a. 将Hypoxyprobe-1固体在室温下避光保存（也可存放在2-8°C）。

b. 将FITC-MAb1和HRP标记的兔抗FITC在2-8°C避光保存。不可冷冻。

Hypoxyprobe-Hypoxyprobe-1 Plus Kit检测步骤：

1、正常或肿瘤组织缺氧的研究开始于通过静脉注射、腹腔注射或口服给予60 mg/kg体重的Hypoxyprobe-1（吡默尼达唑盐酸盐）溶液。对于一只25克的大鼠，这相当于1.5 mg/只。在小鼠中使用高达400 mg/kg的剂量也未发现毒性或组织缺氧的变化，但60 mg/kg的剂量可在最低成本下获得良好的免疫染色。

2、Hypoxyprobe-1在生理盐水中的溶解度为116 mg/ml，因此可以使用非常小的体积来给予Hypoxyprobe-1。注射或摄入后，吡默尼达唑分布到包括大脑在内的所有组织，但仅在氧浓度低于14微摩尔的细胞中与含硫蛋白形成加合物——相当于37°C下的部分压力pO2 = 10 mm Hg。除了肿瘤外，肝脏、肾脏和皮肤等正常组织中也存在pO2 = 10 mmHg时的细胞。这些正常组织会与Hypoxyprobe-1结合。

3、Hypoxyprobe-1在小鼠中的血浆半衰期约为25分钟（有关参考信息，请见www.hypoxyprobe.com上的FAQ链接）。作为比较，大鼠的血浆半衰期为45分钟，犬为90分钟，人类为300分钟。在给予Hypoxyprobe-1后15至90分钟内可以采集感兴趣的大鼠组织。在采集时，组织中存在的Hypoxyprobe-1将在解剖组织缺氧时被结合，但与在15至90分钟实验中组织暴露的Hypoxyprobe-1量相比，残留的Hypoxyprobe-1量非常小，因此由于残留的Hypoxyprobe-1引起的非特异性结合是不可检测的。

图.福尔马林固定的吡嘧达唑结合的免疫过氧化物酶染色

使用1:100稀释度的FITCMAb1和1:100稀释的辣根过氧化物酶偶联的兔抗FITC IgG从啮齿动物肿瘤中切下石蜡包埋组织切片。

Hypoxyprobe 致力于为氧代谢紊乱引起的恶性和正常组织疾病提供诊断和治疗工具。

艾美捷科技是Hypoxyprobe的中国代理商，为科研工作者提供优质的产品与服务。