Hypoxyprobe/艾美捷Hypoxyprobe-1 Kit性能参数&检测说明

Hypoxyprobe-1 Kit应用：免疫化学检测细胞和组织缺氧，包括免疫荧光、免疫过氧化物酶法、西方印迹法或流式细胞术。

规格：

a. Hypoxyprobe-1试剂盒包含100毫克、200毫克或1000毫克的盐酸匹莫地尔。通常在动物研究中使用的剂量为60毫克/公斤体重。

b. 含有60微克/毫升IgG1大鼠单克隆抗体和0.09% Proclin的杂交瘤克隆11.23.22.R的耗尽上清液，体积为1.0或2.0毫升。MAb1的最佳稀释度需由研究人员自行确定，但在与生物素结合的Fab/2抗大鼠二级试剂、链霉亲和素过氧化物酶和过氧化物酶底物组合时，发现1/50的稀释度在大鼠肿瘤组织中能提供强烈的免疫染色。注意，可以使用其他的二级策略。

不包含的内容：

不提供的二级试剂包括生物素结合的Fab/2抗大鼠二级试剂、链霉亲和素过氧化物酶或标准的免疫组化试剂，包括缓冲液、过氧化物酶底物等。

储存：

a. 将盐酸匹莫地尔固体在室温下避光保存。

b. 将大鼠单克隆抗体（MAb1）冷冻保存。为避免反复冻融，建议将抗体分装为小体积后在-20摄氏度下保存。

艾美捷Hypoxyprobe-Hypoxyprobe-1试剂盒（HP1-XXX）组件详细描述：

Hypoxyprobe-1是一种取代的2-硝基咪唑，其化学名称和唯一成分为盐酸匹莫达唑。Hypoxyprobe-1的分子量为290.8，水溶解度为400毫摩尔，相当于116毫克/毫升；在0.9%生理盐水中，其紫外吸收波长为324 nm，消光系数为7020。游离碱基匹莫达唑的分子量为254.3，pKa为8.7，辛醇-水分配系数为8.5。

Hypoxyprobe-1在固态和水溶液中都具有化学稳定性。例如，固态的Hypoxyprobe-1可以在室温下的柔和光线下保存两年，而没有检测到降解，经过紫外和HPLC分析评估。Hypoxyprobe-1的溶液在0.9%生理盐水中以100克/升的浓度在4°C下保存了4.5年，没有检测到降解（紫外和HPLC分析）。

匹莫达唑在缺氧细胞中被还原激活，激活的中间体与蛋白质、肽和氨基酸中的硫醇（巯基）形成稳定的共价加合物。抗体试剂MAb1与这些加合物结合，使其能够通过免疫化学方法进行检测。

MAb1是一种大鼠IgG1单克隆抗体（MAb）克隆11.23.22.R，提供的形式为经过过滤灭菌的、来自杂交瘤克隆11.23.22.R的耗竭上清液，含有60微克/毫升的MAb1和0.09%的Proclin以增加稳定性。感兴趣的组织可以通过以下方法进行研究：在冷冻固定切片或福尔马林固定石蜡包埋切片上进行免疫组化；经过组织解聚后的流式细胞术；或通过Western Blot。通常，向组织切片中添加100微升1:50稀释的MAb1。然后应用适当的二级策略以揭示匹莫达唑加合物。下面提供了两种合适的实验方案示例。

注意：MAb1可以结合缺氧细胞中匹莫达唑的蛋白质、肽和氨基酸加合物，但免疫组化检测的组织处理会洗脱小分子肽和氨基酸加合物，因此缺氧的免疫组化检测依赖于缺氧组织中匹莫达唑的蛋白质加合物。

Hypoxyprobe-Hypoxyprobe-1 Kit检测说明：

1.正常组织或肿瘤组织缺氧的研究始于通过静脉输注、腹腔注射或口服摄入Hypoxyprobe-1溶液，推荐剂量为60 mg/kg体重。对于25克的小鼠，这相当于1.5 mg/mouse。（在小鼠中使用的剂量最高可达400 mg/kg，但没有发现明显的毒性或组织缺氧的变化，60 mg/kg的剂量则以最低成本提供了良好的免疫染色效果。）Hypoxyprobe-1在生理盐水中的溶解度为116 mg/ml，因此可以使用非常小的体积来给药。

注射或摄入后，Hypoxyprobe-1会分布到包括大脑在内的所有组织，但仅在氧浓度低于14微摩尔的细胞中与含硫蛋白形成加合物——相当于37°C下的部分压力PpO2 = 10 mmHg。除了肿瘤，肝脏、肾脏和皮肤等正常组织也含有部分压力PpO2为10 mmHg的细胞。这些正常组织能够结合Hypoxyprobe-1。

2.Hypoxyprobe-1在小鼠体内的血浆半衰期约为25分钟（有关参考文献，请参见www.hypoxyprobe.com的FAQ链接）。相比之下，大鼠的血浆半衰期为45分钟，狗为90分钟，人类为300分钟。通常在Hypoxyprobe-1给药后60到90分钟收集大鼠感兴趣的组织。在取样时，组织中残留的Hypoxyprobe-1在组织缺氧时会被结合。然而，与在60到90分钟实验中组织接触的Hypoxyprobe-1的数量相比，残留的Hypoxyprobe-1数量非常少，因此由于残留的Hypoxyprobe-1导致的任何非特异性结合都是不可检测的。

3.除了动物研究，Hypoxyprobe试剂盒还可以用于细胞培养中的细胞。通常，细胞悬液在100至200微摩尔的Hypoxyprobe-1存在下，在缺氧条件下孵育1到2小时。通过细胞离心收集细胞，固定后用单克隆抗体MAb1及显色或荧光二级试剂进行免疫染色。

文献参考：

1. Clear-Rite 3 -- a less toxic alternative to xylene -- is available from VWR (Cat# 84000-052). For dewaxing (step 2) and tissue rehydration (steps 3-7), ProbeOn Plus slides (Fisher Scientific; Cat# 15-188-52) are held vertically in a MicroProbe Staining Station (Fisher Scientific) in pairs with tissue sections facing each other. The paired slides are dipped in solvent allowing capillary action to carry solvents over the tissue sections. Solvent is removed by blotting the lower end of the slide pair on adsorbent filter paper. The dip and blot procedure is repeated a total of 10 times for each of steps 2-7.Note: These steps were designed for the MicroProbe Staining Station but other routine IHC procedures can be used.

2. Brij 35 is enzyme grade polyoxyethylene(23)lauryl ether available from Fisher Scientific (cat# BP345-500).

Alternatives to Brij35 can be used including Tris buffered saline (TBS) available from Chemicon International,

Temecula, CA (Cat# 20845) containing a final concentration of 0.1% Tween 20.

3. PBS = 10 mM phosphate buffered saline that can be prepared from tablets available from Sigma (Cat# P-4417)

Hypoxyprobe 致力于为氧代谢紊乱引起的恶性和正常组织疾病提供诊断和治疗工具。

艾美捷科技是Hypoxyprobe的中国代理商，为科研工作者提供优质的产品与服务。