HyStem-HP水凝胶在骨再生过程中的重要作用

HyStem-HP含有硫醇化透明质酸、肝素和明胶，可轻松制作 3D 水凝胶。 HyStem-HP 2.0 版提供与 HyStem-HP 1.0 版相同的细胞环境。 HyStem V2.0 套件组件现在将使用缓冲的 1X PBS 进行重构。所得组分还将产生 pH 值中性的等渗盐水凝胶。版本 1.0 至版本 2.0 的最终 pH、渗透压和流变特性相同。 HyStem-HP 水凝胶是完全化学定义的，非常适合细胞应用，其中生长因子的缓慢、持续释放对于重建所需的微环境至关重要。 HyStem-HP 水凝胶试剂盒包含硫醇修饰的透明质酸和硫醇修饰的肝素 (Heprasil)、硫醇修饰的变性胶原蛋白 (Gelin-S) 和硫醇反应性交联剂 PEGDA (Extralink) 的组合。 HyStem-HP 水凝胶中的固定肝素模拟了细胞外基质中通常存在的硫酸肝素蛋白聚糖。

研究表明，细胞间通讯在骨再生过程中扮演着重要角色，而细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）作为细胞间通讯的重要媒介，近年来受到了广泛关注。

EV输送系统改善了骨骼修复：手术后0至8周活体小鼠的微型CT扫描。EV组是右侧缺陷，凝胶组是左侧缺陷。

实验方法：

1. 细胞培养和EVs的提取

从健康捐赠者的骨髓中分离并培养BMSCs。

收集BMSCs培养上清液，通过梯度超速离心法提取EVs。

通过透射电镜和流式细胞术验证EVs的形态和表面标记物。

2. 成骨细胞分化实验

体外实验：将提取的EVs加入成骨细胞培养基中，通过Alizarin Red染色观察钙沉积情况，以及通过qPCR和Western Blot检测成骨相关基因（如RUNX2、ALP、OCN、OPN）的表达水平。

细胞周期和增殖分析：通过流式细胞术（FACS）和MTT实验分析EVs对成骨细胞增殖的影响。

3. microRNA测序和功能验证

microRNA测序：通过RNA测序技术比较BMSCs和EVs中microRNA的表达谱，发现miR-196a、miR-27a和miR-206在EVs中高度富集。

功能验证：将miR-196a、miR-27a和miR-206的模拟物（mimics）和抑制剂分别转染成骨细胞，观察其对成骨分化的影响。

4. 动物实验

模型建立：在SD大鼠颅骨上制造直径为5mm的临界尺寸骨缺损，实验组填充含EVs的水凝胶，对照组仅填充水凝胶。

评估方法：通过micro-CT扫描、组织学和免疫组化染色评估新骨形成情况。

实验结果：

1. EVs的提取和鉴定

电镜观察：EVs呈典型的杯状结构，直径在30-100 nm之间。

流式细胞术：EVs表达典型的EVs标记物CD63。

2. EVs对成骨细胞分化的影响

体外实验：EVs处理组成骨细胞钙沉积显著增加，成骨相关基因表达上调。

细胞增殖分析：EVs对成骨细胞增殖的影响较小，主要促进成骨分化。

3. microRNA在EVs中的作用

测序结果：miR-196a、miR-27a和miR-206在EVs中高度富集。

功能验证：miR-196a在促进成骨分化方面作用最为显著，其抑制剂可部分逆转EVs的成骨分化效应。

4. 动物实验结果

micro-CT扫描：实验组新骨形成显著多于对照组。

组织学染色：HE和Masson染色显示实验组骨缺损区域新骨形成良好，骨小梁结构完整。

在本研究的体内实验中，HyStem-HP水凝胶（#GS314F #GS315F#GS1006F，巯基修饰透明质酸，明胶和肝素水凝胶试剂盒）作为EVs的载体被成功应用于颅骨缺损模型中。HyStem-HP水凝胶具有良好的生物相容性和可降解性，能够为EVs提供一个稳定的释放环境，延长其在缺损部位的滞留时间，从而提高EVs的生物利用度和治疗效果。此外，HyStem-HP水凝胶还能够促进细胞的黏附和增殖，进一步增强骨再生的效果。因此，HyStem-HP水凝胶在本研究中作为EVs的载体，对于实现EVs在体内的有效释放和骨再生的促进具有重要作用和价值。