更高光稳定性、更高荧光强度的异硫氰酸荧光素（FITC）

异硫氰酸荧光素 (FITC) 是荧光素的衍生物，可用于包括流式细胞术在内的广泛应用。首次描述于 1942 年，FITC 是用异硫氰酸酯反应基团 (-N=C=S) 功能化的原始荧光素分子，取代了结构底部环上的氢原子。它通常以异构体的混合物形式提供，即 5-异硫氰酸荧光素 (5-FITC) 和 6-异硫氰酸荧光素 (6-FITC)。 FITC 对亲核试剂（包括蛋白质上的胺和巯基）具有反应性。它由 Robert Seiwald 和 Joseph Burckhalter 于 1958 年合成。连接到荧光素核心的琥珀酰亚胺酯官能团形成“NHS-荧光素”，形成另一种常见的胺反应性衍生物，在其他亲核试剂存在下对伯胺具有更大的特异性。

异硫氰酸荧光素 (FITC)具有大约 495 nm 和 519 nm 的激发和发射光谱峰值波长，使其呈绿色。像大多数荧光染料一样，它容易发生光漂白。由于光漂白问题，Alexa 488 和 DyLight 488 等荧光素衍生物已针对需要更高光稳定性、更高荧光强度或不同附着基团的各种化学和生物应用进行了定制。此外，一些实验利用 FITC 的光漂白倾向，通过光漂白后的荧光恢复技术来测量蛋白质在膜中的横向迁移率。

艾美捷异硫氰酸荧光素相关参数：

产品编号：B-CHM100

规格：100毫克

存储条件：在避光的条件下，存放于-20°C。

分子式：C21H11NO5S

分子量：389.38

纯度：高于或等于95%（通过高效液相色谱法测定）

光谱特性：激发/发射波长 = 490 / 525 纳米

外观：黄色粉末

运输与储存

储存条件：在避光的条件下，存放于-20°C。稳定性：在适当的储存条件下，至少稳定12个月。

异硫氰酸荧光素标记抗体流程：

1. 将要进行交联的蛋白质（浓度为1 mg/mL）在4°C下对交联反应缓冲液进行三次透析，调整pH值至9.0。制备交联缓冲液：将7.56克碳酸氢钠、1.06克碳酸钠和7.36克氯化钠溶解在水中，最终体积为1升。

2. 将FITC在DMSO中溶解，浓度为1 mg/mL。为每次交联反应新鲜制备FITC溶液，并避免光照。

3. 以P:F（蛋白质：FITC）= 1 mg:150 μg的比例，缓慢地将FITC加入抗体溶液中。在加入FITC时轻轻搅拌溶液，以确保与抗体均匀混合。在4°C的暗处进行反应8小时。

4. 加入5 mol/L的氯化铵至最终浓度为50 mmol/L，以在4°C下停止反应2小时。

5. 将结合物对PBS溶液进行至少四次透析，直到透析液变清。

6. 交联材料的特征化：蛋白质浓度（mg/mL）= [A280 - 0.31 × A495] / 1.4；F/P比值：3.1 × A495 / [A280 - 0.31 × A495]。这个值应该在2.5 ~ 6.5之间。

7. 将FITC蛋白结合物在pH 7.4的PBS中保存，添加0.1%的亚硝酸钠和1%的牛血清白蛋白（BSA），在4°C的暗处保存。