MITO-ID膜电位检测试剂盒文献分析--研究方法及结果讨论

背景：

口腔鳞状细胞癌（OSCC）是非常常见的口腔癌类型，占所有口腔癌的90%以上。在2020年，全球估计有430,000例新的OSCC诊断和约200,000例相关死亡。尽管手术和辅助放疗化疗有所改进，OSCC的预后仍然较差，中位生存时间为37.6个月，5年生存率为64.4%。OSCC的不良预后包括局部侵袭、转移和复发。目前对OSCC复发机制的理解不足，缺乏有效的预后预测因子。肿瘤复发是癌症治疗失败的主要原因，因此理解肿瘤复发的机制对于提高治疗效果至关重要。系统方法，包括基因组学，是开发更有效的癌症预后和预测因子的关键。氧化磷酸化（OXPHOS）是一种代谢途径，它在癌细胞的能量代谢中起作用。早期研究表明，与正常细胞相比，癌细胞的糖酵解增加。然而，近期的研究表明，在某些癌症中，包括乳腺癌、肺癌和急性髓系白血病（AML），OXPHOS增加，且OXPHOS是癌症干细胞（CSCs）的首选能量产生过程。针对OXPHOS的治疗可能抑制癌症的恶性行为，因此，本研究旨在开发和验证一个新颖且强大的基因签名，以预测OSCC的预后，并揭示导致治疗失败的恶性和进展机制，以识别OSCC的治疗策略。

文献标题：Gene signature predicting recurrence in oral squamous cell carcinoma is characterized by increased oxidative phosphorylation

DOI:10.1002/1878-0261.13328

研究内容：

本研究的核心内容是开发和验证用于预测口腔鳞状细胞癌（OSCC）患者预后的基因签名，并探索与OSCC复发相关的生物学机制。研究团队通过Cox回归分析识别出一个与OSCC复发相关的基因签名（ORGS），并通过功能富集分析揭示了ORGS背后的生物学途径和过程。特别地，研究发现氧化磷酸化（OXPHOS）信号通路与ORGS相关，并且与OSCC患者的总体生存率差有强烈的关联。此外，研究还发现中介体复合物亚单位30（MED30）是OXPHOS的上游调控因子，其敲低可以减少组蛋白乙酰化，影响OXPHOS基因的表达，进而影响OSCC的预后。

研究方法：

1. 数据收集：研究者从TCGA数据库下载了OSCC患者的基因表达数据和临床信息，包括20530个基因表达数据和520个HNSCC患者的临床信息。

2. 基因签名开发：使用Cox比例风险模型，研究者确定了210个基因作为OSCC复发相关的基因签名（ORGS），其中包括123个高风险基因和87个低风险基因。

3. 功能富集分析：通过基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，研究者分析了ORGS相关的功能和途径。

4. 独立队列验证：研究者在两个独立的数据集（FHCRC和KHU）中验证了基因表达签名，使用支持向量机（SVM）算法来分类患者。

5. 上游调控因子分析：使用INGENUITY PATHWAY ANALYSIS（IPA）软件，研究者进行了上游调控因子分析，以识别OXPHOS基因的上游调控因子。

6. 细胞培养和转染：研究者对人类OSCC细胞系HSC3和HSC4进行培养，并进行了siRNA转染以沉默MED30基因。

7. 分子生物学实验：包括实时定量PCR（qRT-PCR）、西方印迹分析（Western blotting）、线粒体膜电位（MMP）检测、活性氧（ROS）生成检测和凋亡分析等实验，以探究MED30对OXPHOS基因表达和OSCC细胞功能的影响。

结果讨论：

ORGS成功将OSCC患者分为低风险和高风险两组，两组的总体生存率有显著差异，通路分析显示OXPHOS与ORGS在OSCC中相关，且高OXPHOS状态与OSCC患者预后差强相关。MED30作为OXPHOS的预测上游调控因子，其敲低可以减少组蛋白乙酰化；ORGS与OXPHOS调节过程强烈相关，表明OXPHOS是导致OSCC预后不良的关键机制。研究还发现MED30敲低会增加ROS生成并诱导凋亡，暗示MED30敲低可能通过ROS生成诱导凋亡。综上所述，这项研究不仅开发了一个新的基因签名ORGS来预测OSCC的复发，还揭示了OXPHOS和MED30在OSCC中的重要作用，为OSCC的治疗提供了新的靶点。

艾美捷 Enzo的MITO-ID膜电位检测试剂盒Membrane potential detection kit（货号：ENZ-51018）使用简单的混合读取，无清洗协议监测能量状态。它包括一个双发射阳离子染料来测量活细胞中的线粒体膜电位（MMP）。亮点包括：

灵敏度比JC-1 （Invitrogen）高10倍，水溶性好；

活细胞的真正混合-读取均质试验；

优化了荧光显微镜，流式细胞术，微孔板阅读器，和高应用程序吞吐量；

在文献中，MITO-ID Membrane Potential Detection Kit?的主要应用是检测活细胞中的线粒体膜电位（Mitochondrial Membrane Potential, MMP）。以下是其具体应用的详细描述：

1．线粒体膜电位的测定：MITO-ID Membrane Potential Detection Kit包含一种双发射阳离子染料，用于测定活细胞中的线粒体膜电位（MMP）。在有能量或活跃的细胞中，MITO-ID? 膜电位试剂因其相对负电荷而在线粒体中迅速聚集成发橙色荧光的聚合体，而在细胞质中则以发绿色荧光的单体存在。

2．细胞健康和凋亡的评估：线粒体膜电位的丧失通常与细胞凋亡的早期阶段有关。因此，MITO-ID?试剂盒可以作为评估细胞健康程度、线粒体膜通透性和细胞凋亡的一个重要工具。

3．药物诱导毒性和细胞凋亡研究：评估线粒体功能状态的基于细胞的检测方法正在成为阐明线粒体活动在药物诱导毒性、细胞凋亡级联以及其他细胞和生化过程中的作用的有用工具。

4．荧光显微镜和流式细胞术的应用：MITO-ID Membrane Potential Detection Kit优化了用于荧光显微镜和流式细胞术的线粒体膜电位（MMP）和细胞活性的测量。在荧光显微镜下，MITO-ID?膜电位染料是双发射探针，在细胞质中发出绿色荧光，在线粒体中发出橙色荧光。当添加像CCCP这样的扰动药物时，染料主要以绿色荧光单体存在于细胞质中，在线粒体中不再表现出橙色荧光。

5．高通量应用：该试剂盒适合于高通量应用，包括化学/环境毒性筛选，无需洗涤步骤，是一个真正的混合即读均质测定法，适用于活细胞。

综上所述，MITO-ID Membrane Potential Detection Kit在文献中主要应用于测定活细胞中的线粒体膜电位，评估细胞健康和凋亡，以及在药物毒性和细胞凋亡研究中的应。