DNA Shuffling试剂盒的随机突变&试验准备

Jena Bioscience-DNA Shuffling试剂盒提供了每种技术所需的所有组件，并配有简化的文档，以Z大限度地提高成功率。

艾美捷DNA Shuffling试剂盒 #PP-103组分：

DNase I（黄色瓶盖）：0.1单位/微升，100微升

消化缓冲液（蓝色瓶盖）：10倍浓度，100微升

DNase终止溶液（黄色瓶盖）：100微升

Taq聚合酶（红色瓶盖）：5单位/微升，40微升

洗牌缓冲液（绿色瓶盖）：10倍浓度，200微升

dNTP混合物（白色瓶盖）：每种dNTP（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）10 mM，40微升

PCR级水（白色瓶盖）：3乘以1毫升

DNA Shuffling的随机突变

DNA Shuffling是一种体外定向进化蛋白质的强大技术。它通过重组来自一个或多个相关基因的基因片段来产生结构多样性。

DNA Shuffling可以分为单基因Shuffling和多基因Shuffling。在单基因Shuffling中，只有一个基因被消化，随后重新组装，导致点突变的发生率约为0.7%。

DNA Shuffling在蛋白质进化中的主要应用是多基因Shuffling（通常称为分子育种）。在这项技术中，多个同源DNA序列被消化，随后重新组装。结果是包含额外点突变的嵌合基因库。

DNA Shuffling中的关键步骤是对感兴趣的基因进行消化，以产生合适大小的片段。因此，试剂盒中的所有试剂都经过优化，以便在方便的时间框架内获得所需大小的片段。

通常，使用平均大小为70-280 bp的片段会获得最佳结果。请注意，完全的DNase I消化会产生非常短的片段，这些片段无法通过后续的PCR进行扩增。

推荐试验准备：

目标基因的DNase I消化

对于总体积为50微升的反应，使用5微升10倍消化缓冲液在一个合适的管中，并添加0.5-2微克的起始DNA

添加PCR级水至最终体积为50微升

每微克起始DNA添加0.1单位（1.0微升）的DNase I

根据所需的片段大小，在37°C下孵化最多8分钟（参见图2）

通过添加5微升DNase终止溶液来中止消化，然后在75°C下加热灭活DNase I 10分钟。

通过琼脂糖凝胶电泳分离所需大小范围的片段，并使用标准程序进行纯化。

第一轮PCR（无引物）：

对于50微升的反应，取5微升10倍洗牌缓冲液在一个合适的管中，并添加来自步骤1的纯化DNA片段至最终浓度为10-20纳克/微升

添加1微升dNTP混合物

添加2.5单位（0.5微升）的Taq聚合酶

添加PCR级水至最终体积为50微升

推荐的热循环条件：

变性：94°C 90秒

退火：55°C 30秒

延伸：72°C 30秒

循环次数：30-45

使用标准程序纯化PCR产物

第二轮PCR（有引物）：

对于50微升的反应，取5微升10倍洗牌缓冲液，并添加2微升来自步骤2的PCR产物

添加1微升dNTP混合物

添加引物至最终浓度为0.8微摩尔/升

添加2.5单位（0.5微升）的Taq聚合酶

添加PCR级水至最终体积为50微升

推荐的热循环条件：

变性：94°C 30秒

退火：55°C 30秒

延伸：72°C 30秒

循环次数：15

DNA Shuffling试剂盒相关产品：

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