EdU法细胞增殖成像分析试剂盒（绿色荧光）程序分析

EdUCellProliferation试剂盒，用于成像（绿色荧光）是BrdU测定的一种新的替代品。EdU（5-乙炔基-2?-脱氧尿苷）是胸苷的核苷类似物，在活性DNA合成过程中被掺入DNA。与BrdU测定相比，EdU点击分析不是基于抗体的，因此不需要DNA变性（通常使用HCl或加热或用DNase消化）来检测结合的核苷。检测基于点击反应，这是叠氮化物和萘醌之间铜催化的共价反应，在30分钟内完成。

艾美捷EdU法细胞增殖成像分析试剂盒（绿色荧光）基本参数：

目录号：D-AKK2030

规格：100T

储存：在-20°C下储存12个月，避光

EdU法细胞增殖成像分析试剂盒（绿色荧光）程序分析：

A.细胞使用EdU标记

在这个实验中，以96孔板中的贴壁细胞为例。悬浮细胞可以在孵育EdU后涂抹（将适量的细胞加到玻片上，用酒精灯烘干）。涂抹后，染色步骤与贴壁细胞相同。

1. 在孔板中放置适当的玻片，在孔中种植适量的细胞，并在处理细胞后使其达到所需的密度。

2. 可选步骤：设置阴性对照。在EdU孵育之前加入DNA合成抑制剂羟基脲，按1:1000的比例直接加入阴性对照孔中，混匀并孵育0.5小时。

3. 使用细胞培养基中的10mM EdU溶液制备2倍浓度的EdU工作溶液（20μM）。推荐的最终EdU浓度为10μM，通过将10mM EdU与细胞培养基按1:500稀释可以得到2倍浓度的EdU工作溶液（20μM）。

4. 预热至37°C的2倍浓度的EdU溶液与含有待测细胞的培养基加入相同体积，使96孔板中EdU的最终浓度为1倍。

注意：推荐不要更换所有培养基，因为这会影响细胞增殖速率；推荐初始EdU浓度为10μM。

5. 在最适宜的条件下孵育细胞2小时（根据细胞扩展的时间，一般肿瘤细胞的孵育时间为2小时）。

6. 孵育结束后，移除培养基，向每个孔中加入0.1mL固定液（含有3.7%甲醛的PBS溶液），在室温下孵育15分钟。

7. 去除固定液，用0.1mL BSA工作溶液（1倍浓度）洗涤每个孔中的细胞，孵育5分钟。重复3次。

8. 去除洗涤液，向每个孔中加入0.1mL穿透剂（含有0.5% Triton X-100的PBS溶液），在室温下孵育15分钟。

9. 去除穿透剂，用0.1mL BSA工作溶液（1倍浓度）洗涤每个孔中的细胞，孵育5分钟。重复2次。

10. 进入C步骤。

B.在活体动物中标记EdU

这个实验以6周龄小鼠为例，其他动物中EdU的标记，请参考相关文献。

1. 对于小鼠，根据10-200 mg/kg的剂量，将EdU与PBS混合制成一定浓度，可以通过腹腔注射、局部注射到特定组织或器官，或者加入饮用水中。具体剂量与使用的动物的类型、体重和使用方式有关，可以参考相关文献，因此建议首次使用时探索EdU的浓度，或直接使用50 mg/kg的浓度进行测试。如果之前使用过BrdU进行实验，可以参考BrdU的最终浓度作为EdU的最终浓度。EdU需要单独购买。

2. 可选步骤：设置阴性对照。在EdU处理期间加入DNA合成抑制剂羟基脲，与EdU溶液按照1000 mg/kg的浓度配制。羟基脲需要单独购买。

3. 经过24小时或根据具体实验确定的适当时间后，迅速杀死小鼠，取出必要的组织，并根据常规步骤制作冰冻切片或石蜡切片。也可以根据相关文献调整EdU标记的时间。

4. 对于冰冻切片：

（1）加入适量的固定溶液（含3.7%甲醛的PBS），室温孵育15分钟。

（2）取出固定剂，用0.1mL BSA工作溶液（1x）洗涤每个孔中的细胞5分钟。重复3次。

（3）取出洗涤剂，向每个孔中加入0.1mL渗透剂（含有0.5%Triton X-100的PBS），并在室温下孵育15分钟。

（4）去除渗透剂，并用0.1mL BSA工作溶液（1x）洗涤每个孔中的细胞5分钟。重复2次。

（5）抗原修复（可选）：如果同时需要对靶蛋白进行免疫荧光染色，并且需要抗原修复，可以使用合适的抗原修复液或自制的合适抗原修复液进行抗原修复。

（6）转到步骤C。

5.对于石蜡切片：

（1）脱蜡：在二甲苯中脱蜡5-10分钟，然后换成新鲜二甲苯，然后脱蜡5-10分钟。无水乙醇和无水乙醇分别脱蜡5分钟和3分钟。95%乙醇3分钟。85%乙醇3分钟.75%乙醇3分钟50%乙醇3分钟.PBS 5分钟。

（2）抗原修复（可选）：如果同时需要对靶蛋白进行免疫组织化学染色，并且需要抗原修复，可以使用合适的抗原修复液或自制合适的抗原修补液进行抗原修复。

注意：如果使用蛋白酶K或胰蛋白酶进行抗原修复，必须反复清洗，否则残留的酶会严重干扰后续的标记反应。

（3）转到步骤C。

C.EdU检测

注：在该步骤中，每个孔使用100μL反应混合物。对于其他孔板或片，可以根据实际情况调整反应混合物的体积，但必须按比例添加反应组分。

1.根据下表制备Click-iT反应混合物。

注意：按照表中列出的顺序添加配料是很重要的；否则，反应不会顺利进行。在制备后15分钟内使用Click-iT反应混合物。

2.取出溶液，向每个样品中加入100μL Click-iT反应混合物，并在室温下孵育细胞30分钟，避光。

3.取出反应混合物，用0.1mL BSA洗涤溶液（1x）洗涤孔中的细胞5分钟，然后取出洗涤溶液。

4.可选步骤：核染色（1xHoechst 33342）或抗体标记。

重要提示：孵化过程中应避免光线照射。如果您不需要其他染色，请在孵化后直接进行图像和分析。

5.用荧光显微镜（Ex/Em=501/525nm）分析样品中标记的DNA，用Ex/Em=360/460nm检测细胞核。

该试剂仅用于科学研究领域，不适用于临床诊断或其他用途。

Biogradetech生命科学和医药研发行业关键原料与试剂的供应商：Biogradetech成立于2015年，总部位于美国加利福尼亚州，早期以产品技术研发服务起家，逐步发展了广泛的产品线，并将其商业化销售，包括蛋白质、抗体、酶、培养基、试剂盒和仪器。适用于细胞生物学、蛋白质组学、分子生物学、免疫学、微生物学、诊断学、生物化学、神经科学、血液分析和高通量药物筛选等领域。