Life Diagnostics：奶牛乳铁蛋白酶联免疫吸附试验标准品/样品准备

乳铁蛋白是一种非血红素铁结合糖蛋白，存在于牛奶、其他分泌液和血液中。作为宿主防御的一部分，它具有抗菌和抗炎活性。它是牛乳腺炎的生物标志物。1,2乳铁蛋白水平从正常牛奶中的低于0.05mg/ml到乳腺炎动物牛奶中的高于8mg/ml不等。

该测定使用亲和纯化的奶牛乳铁蛋白抗体进行固相（微量滴定孔）固定，使用辣根过氧化物酶（HRP）偶联的奶牛乳铁蛋白抗体进行检测。将标准样品和稀释样品在微量滴定孔中孵育45分钟。随后清洗这些井。加入HRP偶联物并孵育45分钟。这导致乳铁蛋白小分子夹在固定抗体和检测抗体之间。然后洗涤孔以去除未结合的HRP缀合物，加入TMB并孵育20分钟。如果乳铁蛋白存在，则会出现蓝色。通过加入Stop溶液停止显色，将颜色变为黄色，并在450nm处测量吸光度。乳铁蛋白的浓度与吸光度成正比，由标准曲线得出。

艾美捷Life Diagnostics标准品准备：

乳铁蛋白标准品为冻干形式。根据瓶签上的指示加入蒸馏水或去离子水的体积，并轻轻混合直至溶解（如果打算将来使用，重新溶解的标准品应分装并存放在-20°C或更低的温度下）。

标记7个聚丙烯或玻璃试管为100、50、25、12.5、6.25、3.13和1.56 ng/ml。

在标记为100 ng/ml的试管中，根据标准品瓶签上的详细说明，用1x稀释液稀释重新溶解的标准品，准备100 ng/ml的标准品。

在标记为50、25、12.5、6.25、3.13和1.56 ng/ml的试管中分别加入250 ?l的1x稀释液。

通过将标记为50 ng/ml的试管中的250 ?l 100 ng/ml标准品与250 ?l稀释液混合稀释，准备50 ng/ml的标准品。

类似地，通过两倍连续稀释准备其余的标准品。

样品准备：

牛奶：为了获得最佳结果，牛奶应处理成脱脂奶或乳清。脱脂奶可以通过在4°C下以>3000g离心牛奶15分钟来获得。乳清是通过用冰醋酸将脱脂奶调节至pH 4.5，然后离心并使用5M NaOH将上清液的pH调节回6.5 – 7.5来准备的。为了获得在标准曲线范围内的值，我们建议每个待测样品使用以下程序进行10,000倍稀释。

向两个试管中分别加入495 ?l的1x稀释液。

将5.0 ?l样品吸入第一个试管并混合。这提供了100倍的稀释。

将5.0 ?l的100倍稀释样品与第二个试管中的495 ?l稀释液混合。这提供了10,000倍的稀释。 血清：正常血清中的乳铁蛋白水平大约为100 ng/ml。为了在检测前避免基质效应，样品必须稀释20倍或更多。

结果计算：

使用曲线拟合软件，通过将标准品的吸光度值与浓度的常用对数对数图绘制标准曲线。

将标准曲线拟合到四参数逻辑回归（4PL）方程（x轴=浓度的常用对数），并从标准曲线确定样品的浓度（记得从反对数中得到浓度）。

将得出的浓度乘以稀释因子，以确定血清或血浆样品中的实际浓度。

如果样品的A450值超出标准曲线范围，应适当稀释样品并重新检测。

参考文献：

1. Kawai K, Hagiwara S, Anri A, Nagahata H. Lactoferrinconcentration in milk of cow clinical mastitis. Vet Res Commun.23(7):391-398 (1999)

2. Harmon RJ et’al. Changes in lactoferrin, immunoglobulin G, cowserum albumin, and a-lactalbumin during acute experimentaland natural coliform mastitis in cows. Infection and Immunity.13:533-542 (1976)

Life Diagnostics 专注于研发和生产临床前研究以及动物医学诊断相关的ELISA试剂盒、纯化的生物标志物和抗体等产品。产品覆盖心血管疾病、急性期反应、免疫毒性和免疫学标志物等研究领域，主要应用于小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猪、猴和鸡等物种。艾美捷科技是Life Diagnostics的中国代理商，为科研工作者提供优质的产品与服务。