操作步骤丨皮质醇ELISA试剂盒简单精准定量

皮质醇ELISA试剂盒运用双抗体夹心ELISA法定量测定其他血清、血浆、组织匀浆、细胞裂解液、细胞培养上清液和其他生物液体中皮质醇含量。

艾美捷皮质醇ELISA试剂盒#K003-H1：

检测范围：0.375nmol/L~12nmol/L

灵敏度：0.1

实验原理：将皮质醇(Cor)抗体包被于96孔微孔板中，制成固相载体，向微孔中分别加入标准品或标本，其中的皮质醇(Cor)与连接于固相载体上的抗体结合，然后加入生物素化的皮质醇(Cor)抗体，将未结合的生物素化抗体洗净后，加入HRP标记的亲和素，再次彻底洗涤后加入TMB底物显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成*终的黄色。颜色的深浅和样品中的皮质醇呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(0.D.值),计算样品浓度。

皮质醇ELISA试剂盒组分：

皮质醇ELISA试剂盒需自备的设备及试剂：

1. 450±10m滤光片的酶标仪(建议仪器使用前提前预热)

2. 单道或多道微量加液器及吸头

3. 稀释样品的印管

4. 蒸馏水或去离子水

5. 吸水纸

6. 盛放洗液的容器

试剂盒的储存及有效期：

1. 未开封的试剂盒：所有试剂均按试剂瓶标签上所示保存。请注意，收到试剂盒后请尽快将TMB洗涤液，终止液保存于4℃,其他试剂保存于-20℃。

2. 使用后的试剂盒：剩余试剂仍需按照试剂瓶标签所示的温度保存，开封后的酶标板要加干燥剂后密封保存于-20°℃,避免潮湿。

注意：

试剂盒内酶标条可拆卸，按实验需求可分多次使用；使用后的剩余试剂盒建议在*实验后1个月内使用完毕。产品过期时间以盒子上的标签为准，保质期内所有组分都确保是稳定的。

皮质醇ELISA试剂盒标本的采集与保存：

1. 血清：

将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4°℃过夜，然后1000×g离心20分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80°℃保存，但应避免反复冻融。

2. 血浆：

用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8°℃1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20°℃或-80°℃保存，但应避免反复冻融。

3.组织匀浆：

1)取适量组织块，于预冷PBS(0.01mol/L.pH 7.0-7.2)中清洗去除血液，称重后备用(组织块较大需先剪碎后再匀浆);

2)可同时选用多种匀浆方法达到较好的破碎效果：首先将组织块移入玻璃匀浆器，加入5-10mL预冷PBS进行充分研磨，该过程需在冰上进行(有条件实验室可选用机器匀浆);得到的匀浆液可再利用超声破碎或反复冻融进一步处理(超声破碎过程中注意冰浴降温；反复冻融法可重复2次)。

3)将制备好的匀浆液于5000×g离心5分钟，留取上清即可检测。

4.细胞裂解液：

1)贴壁细胞需要先用胰酶消化，离心收集细胞(悬浮细胞可直接离心收集);

2)将收集到的细胞用冷PBS洗3次；

3)物理方法裂解细胞(可先超声破碎细胞，再反复冻融):

i超声破碎：取适量PBS重悬细胞，用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂。

ii反复冻融：将待破碎的细胞在-200C以下冰冻，室温融解，反复3次，使细胞溶胀破碎。

4)将标本于2-8 °℃1500×g离心10分钟，收集上清备用。

5.细胞培养上清或其它生物标本：

请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20°℃或-80°℃保存，但应避免反复冻融。注意：

1. 以上标本均需密封保存，4℃保存应小于1周，-20℃不应超过1个月，-80°℃不应超过2个月。

2. 标本使用前应缓慢均衡至室温，不应加热使之融解。

3. 实验前红细胞裂解液必须用标准品稀释液稀释。

皮质醇ELISA试剂盒试剂准备

1. 使用前将所有的试剂和标本缓慢均衡至室温(18-250C),试剂不能直接在370C溶解。

2. 标准品(冻干品):每瓶标准品加入标准品稀释液1mL,盖好后室温静置大约10分钟，同时反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为1000ng/mL。准备7个稀释标准品的印管，每个EP管中加入150μL的标准品稀释液，依次倍比稀释成不同的梯度， 标准品稀释液(0pg/mL)直接作为空白孔。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

3. 浓洗涤液：用580mL蒸馏水或去离子水将20mL浓洗涤液稀释至600mL,进行30倍稀释。

皮质醇ELISA试剂盒操作步骤：

1. 加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μ1,待测样品孔中先加样品

稀释液40μ1,然后再加待测样品10μ (样品*终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

2. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

3. 配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用

4. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

5. 加酶：每孔加入酶标试剂50μ1,空白孔除外。

6. 温育：操作同3。

7. 洗涤：操作同5。

8. 显色：每孔先加入显色剂A50μ1,再加入显色剂B50μ1,轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。

9. 终止：每孔加终止液50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。

10. 测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(0D值)。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。

特异性

本试剂盒用于检测皮质醇(Cor),经检测与其它相似物质无明显交叉反应。

由于受到技术及样本来源的限制，不可能完成对所有相关或相似物质交叉反应检测，因此本试剂盒有可能与未经检测的其它物质有交叉反应。

精密度

精密度用样品测定值的变异系数CV表示。CV(%)= SD/mean×100

批内差：取同批次试剂盒对低、中、高值定值样本进行定量检测.每份样本连续测定20次，分别计算不同浓度样本的平均值及SD值。

批间差：选取3个不同批次的试剂盒分别对低、中、高值定值样本进行定量测定，每个样本使用同一试剂盒重复测定8次，分别计算不同浓度样本的平均值及SD值。

批内差： CV<10%

批间差： CV<12%

皮质醇ELISA试剂盒稳定性：

经测定，试剂盒在有效期内按推荐温度保存，其活性降低率小于5%。

为减小外部因素对试剂金破坏前后检测值的影响，实验室的环境条件需尽量保持一致，尤其是实验室内温度、湿度及温育条件。其次由同一实验员来进行操作可减少人为误差。