Calcein-AM/PI，活细胞/死细胞双染试剂盒染色方案

Calcein-AM是一种常用的对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，发绿色荧光（Ex=490 nm, Em=515 nm）。 因其在传统的Calcein（钙黄绿素）基础上引入乙酰甲氧基甲酯（AM）基团，增加了疏水性，使其能够轻易穿透活细胞膜。一旦进入细胞后Calcein-AM（本身不发荧光）被细胞内的酯酶剪切形成膜非渗透性的极性分子Calcein，从而被滞留在细胞内并发出强绿色荧光。与其它同类试剂（如BCECF-AM和CFDA)相比，由于Calcein, AM细胞毒性极低，适合用于活细胞染色的荧光探针，而且不会抑制任何的细胞功能，如增殖和淋巴球的趋化性。

由于死细胞缺乏酯酶，Calcein-AM仅用于对活细胞的细胞生存能力测试和短期标记。因此，Calcein-AM常常与死细胞荧光探针如碘化丙啶（PI）等联合使用，同时进行活细胞和死细胞的荧光双重染色。碘化丙啶（Propidium iodide，PI）不能穿过活细胞的细胞膜，仅能穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光（Ex=535 nm, Em=617 nm），因此PI仅对死细胞染色。由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。而用545 nm激发，仅可观察到死细胞。本试剂盒适用于荧光显微镜、荧光酶标仪、流式细胞仪以及其他荧光检测系统。

艾美捷的一款基于Calcein AM和PI的活死细胞双染试剂盒(B-CHK103)，本染色方法适用于荧光显微镜、荧光酶标仪等微孔板荧光扫描设备、流式细胞仪或其他的荧光设备。本染色方法适用于大多数真核细胞，包括贴壁细胞和某些组织样本，但不包括细菌和酵母样本。   

Calcein-AM/PI，活细胞/死细胞双染试剂盒组件和存储：

注：500T是指当使用Calcein AM的2μmol/L工作溶液/PI的Landa工作溶液4.5μmol/L时可实现的检测次数，每次使用总计100μL。

Calcein-AM/PI，活细胞/死细胞双染试剂盒染色方案：

1、制备1mM Calcein AM储备溶液。将200μL二甲基亚砜加入含有200μg Calcein AM粉末的试管中，并使用移液管涡旋溶解。将溶液储存在避光的地方，并尽快使用，以避免重复的冻融循环。

2、使用前将Calcein AM储备溶液和PI储备溶液置于室温。使用PBS制备工作溶液。

1）Calcein AM工作溶液的推荐浓度为2μmol/L，PI工作溶液的建议浓度为4.5μmol/L

2）工作溶液浓度可以根据细胞的具体要求进行调整，建议在使用前立即准备染色工作溶液。

3）将100μL染色工作溶液与200μL细胞悬浮液混合，在37°C下孵育15分钟。

4）观察显示黄绿色荧光的活细胞和显示红色荧光的死细胞，同时在490±10nm的激发下。此外，在545的激发下单独观察死细胞nm。

仅供研究使用，不用于人类或临床诊断。

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