CUT&RUN丨一文带你了解CUT&RUN实验的流程和使用指南

CUT&RUN（Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease）是一种用于研究内源蛋白质与DNA相互作用的新技术。它是在2017年由染色质研究领域的大牛Steven Henikoff实验室发明的。这个方法结合了抗体靶向和原位核酸酶剪切的优势，提供了一种高效且精准的方法来分析染色质蛋白结合位点。 类似于ChIP（chromatin immunoprecipitation），CUT&RUN也是利用抗体靶向染色质相关修饰和蛋白，但其所需细胞量和测序深度比传统ChIP更低。

CUT&RUN实验可以用来分析多种蛋白的染色质图谱，包括PTMs，转录因子，染色质remodelers和染色质writers/readers。

CUT&RUN原理：

跟ChIP的靶点覆盖范围类似，CUT&RUN也适用于研究组蛋白修饰、转录因子、染色质修饰酶以及其他DNA结合蛋白在基因组上的结合位点。但跟ChIP不同的是，CUT&RUN是通过抗体靶向和核酸酶原位切割的方法，将目的蛋白结合的DNA从染色质上切割并释放出来。CUT&RUN的主要步骤是首先将细胞通透化，随后加入目的蛋白抗体特异性的结合在目的蛋白处，并招募和protein A/G偶联的微球菌核酸酶（pA/G-MNase），最后加入Ca??激活MNase活性，切割目标区域的DNA并回收，用于qPCR检测或NGS建库测序。

CUT&RUN实验流程：

1. 收获细胞并和beads结合：

收获细胞，并且进行细胞计数，推荐起始细胞数量5千-50万个。用室温的wash buffer对细胞清洗两次后加入ConA beads，室温下温柔孵育5-10min，使细胞结合在beads上。  

2. 细胞通透化处理和一抗孵育

在细胞和beads结合之后，将管子转移到磁力架上弃去上清，并加入适量抗体结合buffer重悬beads。按照1:100或者厂家推荐的浓度加入一抗，室温孵育2h或4℃孵育过夜。

3. 结合pA/G-MNase融合蛋白

抗体孵育完成后，将管子转移到磁力架上弃去上清，并加入适当清洗溶液清洗2-3次，去除未结合到目的蛋白上的多余游离抗体。最后一步清洗完成后，用含有pA/G-MNase融合蛋白的溶液重悬ConA beads，孵育时间最短可以室温孵育10分钟，或者可以4℃孵育1个小时。这一步是为了使MNase通过其融合的protein A/G被抗体招募到目的蛋白结合处。

4. DNA片段化与纯化

pA/G-MNase孵育完成后，将管子转移到磁力架上弃去上清，并加入适当清洗溶液清洗2-3次，去除没有结合到目的蛋白上的游离pA/G-MNase。最后一步清洗完成后，将管子放置在冰上，加入钙离子激活结合到目的蛋白上的pA/G-MNase，使其可以切割目的蛋白结合的DNA，此步孵育反应在冰上进行。切割完成后加入反应终止液，并在37℃孵育30分钟，这是为了将被切割的DNA释放到上清中。随后将管子转移到磁力架上吸附，小心地将上清转移到新的离心管子中。这里就是目的蛋白结合的DNA，随后进行DNA进行纯化回收。

DNA纯化回收后，可以进行文库构建，然后送测序分析。对于太少的细胞，Epigentek不太推荐做qPCR，因为起始细胞比较少，得到的目的DNA量非常低，qPCR的循环数会非常高。

艾美捷 EpiNext? CUT&RUN RNA m6A-Seq试剂盒使用指南：

旨在从微量RNA输入中富集含有m6A的RNA片段，并为使用Illumina平台（如Illumina Genome Analyzer II、HiSeq和MiSeq系统）的下一代测序准备文库。试剂盒的创新工作原理、优化的协议和组分允许以最小的非特异性背景水平捕获m6A片段。富集的RNA特别适合快速构建非条形码（单重）和条形码（多重）文库，允许以较小的偏差和高分辨率映射m6A区域。

输入量： 一般来说，每个反应的总RNA量可以是1微克到20微克。为了最佳准备，输入量应该是10微克RNA，尽管使用总量低至500纳克的RNA也可以获得CUT&RUN RNA m6A-Seq数据。

起始材料： 起始材料可以包括各种哺乳动物细胞样本，如来自培养瓶或板的培养细胞、从血液、体液和新鲜/冷冻组织中分离的原代细胞或稀有细胞群体、从整个细胞群体中分选的特定细胞和胚胎细胞等。

抗体： 该试剂盒中使用的抗m6A兔多克隆抗体对m6A RNA片段具有高度特异性，具有MeRIP级，并且不与未甲基化的腺嘌呤RNA片段发生交叉反应。

内部对照： 该试剂盒提供了一个阴性对照非免疫IgG。

注意事项： 为了避免交叉污染，请小心地将样本或溶液滴入试管中。使用防气溶胶的移液管头，并在液体转移之间始终更换移液管头。在整个过程中佩戴手套。如果手套与样本接触，请立即更换手套。