CUT&RUN试剂盒丨高富集度CUT&RUN试剂盒的检测原理

体内富集与组蛋白或转录因子（TF）复合的DNA，随后进行下一代测序，为研究全基因组蛋白质-DNA相互作用提供了一个有利的工具。 它允许分析特定蛋白质在活细胞中与DNA序列的结合。这种分析要求方法可靠地识别真正的目标蛋白质富集区域，特别是来自有限的细胞样本。这些样本可能包括从组织中分离出来的稀有细胞群体、从整个细胞群体中分选出来的特定细胞，以及如胚胎细胞等原代培养的亚群体细胞。此外，该方法应确保富集的DNA含有最小的背景，并且以最小的偏差和高分辨率映射蛋白质-DNA结合区域。

长期以来，实现这一目标的主要方法是染色质免疫沉淀，随后进行测序（ChIP-Seq）。 然而，ChIP的主要限制是它需要1）大量的输入材料，细胞或组织，以产生足够强的信号以覆盖背景噪声；以及2）在初始固定步骤中进行交联。目前有几种先进的方法可用于ChIP-Seq，以减少细胞数量或提高分辨率。这些方法包括ChIP-exo和ChIPmentation。ChIP-exo提供高分辨率映射，但耗时且需要大量输入细胞。而ChIPmentation使用转座酶和与测序兼容的适配器，以实现ChIP过程中的连接整合，它遵循传统的慢速（2天）ChIP程序，无法实现高分辨率映射。

CUT&RUN（Cleavage Under Target & Release Using Nuclease，目标下切割与释放使用核酸酶）是为释放有限生物材料中捕获的目标蛋白质/DNA复合物以映射蛋白质-DNA相互作用而开发的，它显著提高了映射分辨率。 然而，CUT&RUN需要昂贵的PA/Mnase融合蛋白，该蛋白具有显著的A/T序列偏差，导致目标蛋白质相互作用的DNA区域轮廓受到MNase消化水平的严重影响。因此，作为一种改进，我们开发了一种新技术：目标下切割并使用核酸酶快速恢复（CUT&RUN Fast），用于富集组蛋白或转录因子结合的DNA。我们的创新方法结合了ChIP-exo和CUT&RUN的优势，并具有超级快的程序，将其整合到EpiNext? CUT&RUN Fast试剂盒中。

艾美捷CUT&RUN试剂盒具有以下特点：

高富集度： 使用一种独特的核酸切割酶混合物，这种酶具有低序列偏差，能够同时将染色质片段化，并在目标蛋白质/DNA复合物的两端切割/移除任何DNA序列，而不影响目标蛋白质占据的DNA。富集的DNA片段大于20个碱基对，可以高效快速地回收。因此，可以在高分辨率映射中可靠地实现和识别目标蛋白质富集区域。

低输入材料： 强大的无需超声的片段化、未结合DNA的切割和免疫捕获都在同一个单管中进行，使用珠上连接。这种方法适用于细胞和组织，并允许最大限度地保护目标蛋白质的降解，同时最小化样本损失。结果，输入的细胞数量可以少至500个，或者染色质的量可以低至0.1微克。

最小化背景： 在目标蛋白质/DNA复合物的两端原位切割未结合的DNA序列，能够最小化免疫捕获的背景，允许进行少于1000万次读取的测序数据分析。

快速、流程简化的程序： 从细胞到文库DNA的程序不到3小时。

高度便捷： 试剂盒包含了CUT&RUN每个步骤所需的所有组分，因此EpiNext? CUT&RUN Fast试剂盒是最方便的，能够提供可靠和一致的结果。

EpiNext? CUT&RUN Fast试剂盒包含了从哺乳动物细胞或分离的核/染色质开始执行成功CUT&RUN所需的所有必要试剂。 在反应中，从细胞中分离出核。目标蛋白质-DNA复合物通过感兴趣的CHIP级抗体进行结合/捕获。使用一种独特的核酸切割酶混合物，染色质被片段化，目标蛋白质/DNA复合物两端的DNA序列被切割/移除。同时，目标蛋白质占据的DNA序列不受影响。然后对目标蛋白质结合的DNA进行纯化和洗脱。富集的DNA可用于分析蛋白质-DNA相互作用，尤其是用于下一代测序。

试剂盒中包括： 一个阳性对照抗体（抗H3K9me3）、一个阴性对照非免疫IgG，以及控制染色质，这些可以用来在PCR/生物分析仪步骤中展示试剂盒的效果和性能。

CUT&RUN试剂盒检测原理：

图 1. EpiNext? CUT&RUN Fast试剂盒的工作流程。

图 2. 使用EpiNext? CUT&RUN Fast试剂盒进行目标蛋白质/DNA富集： 通过控制抗体（抗H3K9me3和抗RNA聚合酶II，EpigenTek）从100,000个Jurkat细胞中捕获组蛋白/DNA复合物。非免疫IgG作为对照。富集的DNA被纯化并通过荧光定量以比较富集倍数。

图3。库片段的大小分布。使用EpiNext?CUT&RUNFast试剂盒，组蛋白DNA复合物被对照抗体（H3K9me3）从Hela细胞分离的1 ug染色质中捕获，并用于DNA文库制备。290 bps左右的峰值反映了单核小体的插入大小（150 bps）。