Rho 激活剂 II的用途及生物活性检测说明

G-switch?系列小G蛋白工具系列的开发侧重于创建针对内源性Rho家族蛋白和信号通路的高效试剂。与依赖于过表达或敲降目标蛋白的方法（例如，DNA转染显性负性或常活性Rho突变体，RNAi敲降）相比，G-switch?试剂能够迅速作用于内源性目标蛋白（根据产品而定，时间范围为分钟至小时），从而优化产生更具生理学相关性的反应的机会。G-switch?产品系列包括直接和间接调节Rho家族信号传导的试剂，因此提供了广泛的机制工具来研究这些关键的细胞功能。请访问Cytoskeleton公司的网站获取最新的G-switch?信息。

CN03的活性位点基于细菌细胞毒性坏死因子（CNF）毒素的催化结构域。催化结构域与一种专有的细胞穿透基团共价结合。CN03通过脱氨酰胺化位于这些GTP酶的Switch II区域的谷氨酰胺-63来激活Rho GTP酶亚型（1）。这种修饰将谷氨酰胺-63转变为谷氨酸，从而阻断了固有和GAP刺激的GTP酶活性，导致Rho的常活性（2）。在添加到培养基后的2-4小时内，CN03显著增加了GTP结合的RhoA水平。此外，这种激活剂的有针对性作用使其比经典的间接激活剂（例如，LPA）更具吸引力，后者同时激活其他信号通路（例如，Ras、PI3K和PLC）。

艾美捷Rho 激活剂 II（#CN03）用途包括：

Rho通路激活剂

研究Rho活化对细胞运动的影响

研究Rho活化对肌动蛋白细胞骨架重排的影响

研究 Rho 激活对与其他信号转导通路串扰的影响

材料：

CN03是在细菌表达系统中制备的。重组蛋白的分子量为118 kDa，并在其氨基端含有六个组氨酸残基（His标签）。经过固定金属亲和层析（图1），已经纯化至80%以上的纯度。每个小瓶中提供的是白色冻干固体，含有20 ?g的CN03蛋白。该物质已经在RhoA激活的生物学检测中显示出活性（见下文）。在RhoA激活的生物学检测中，一个包含单点突变的蛋白质失活突变体显示出零活性（未显示数据）。

储存和重溶：

在常温下运输。冻干的蛋白质可以在4°C下干燥储存6个月。CN03的冻干颗粒可能看起来松散且轻包装，但这不会影响CN03的质量或性能。为了重溶，简单离心以收集管底的产物，然后将每个小瓶中的产物重悬于200 ?l无菌水中，放在冰上静置10分钟，轻轻上下吸移混匀，得到0.1 ?g/?l的浓度。在使用之前，CN03应进一步与无血清培养基稀释至0.25至5 ?g/ml的浓度（由用户确定，参见图2和表1）。通常，在3小时内，1 ?g/ml的浓度能够在多种细胞类型中产生强大的RhoA激活。重溶的激活剂可以在液氮中快速冷冻，并在–70°C下储存长达6个月。

Rho 激活剂 II生物活性检测：

在37°C孵育2小时后，CN03（1 ?g/ml / 相当于10 ?l/ml）显示出在瑞士3T3细胞中引发了十倍的RhoA激活（图2和图3）和应力纤维诱导（图4）。在表1中详细介绍了在几种细胞类型中激活Rho的推荐条件。

活性检测方法：瑞士3T3细胞激活

1. 在两个含有10 ml DMEM / 10%胎牛血清（FBS）的10 cm?培养皿中，将瑞士3T3细胞以37°C / 5% CO2培养至30%的密度。

2. 将培养基更换为DMEM / 1% FBS，饥饿细胞24小时，然后转移到DMEM / 0% FBS培养24小时。

3. 简要离心CN03管，使其沉淀在管底。

4. 用200 ?l无菌水（0.1 ?g/?l）重溶CN03-请参见上面的储存和重溶部分。

5. 用温暖的DMEM将CN03稀释至1 ?g/ml。

6. 吸去培养皿中的培养基，将含有CN03的培养基转移到一个培养皿中。

7. 只向第二个培养皿中加入温暖的DMEM。这是对照组，代表未刺激的细胞。

8. 在37°C和5% CO2下孵育2小时。通过G-LISA?分析（Cat. # BK124；图2和图3）或细胞形态学（Cat. # PHDG1；图4）来检测Rho活性。

Rho 激活剂 II文献参考： 

1. Schmidt G., et al. 1997. Gln 63 of Rho is deamidated by Escherichia coli cytotoxic necrotizing factor-1. Nature. 387, 725-729.

2. Flatau G., et al. 1997. Toxin-induced activation of the G protein p21 Rho by deamidation of glutamine. Nature. 387, 729-733.

Cytoskeleton公司成立于1993年，专注于生物化学和细胞过程研究中的纯化蛋白和便捷试剂盒开发与生产。公司提供药物筛选、信号转导、蛋白质转录后修饰（PTM）、细胞骨架研究相关的系列试剂盒和产品，尤其以细胞骨架相关研究见长，既能满足于样品较少的科学研究，也可以用于小规模筛选研究和高通量大规模筛选研究。此外，公司还提供微管蛋白，肌动蛋白，小G蛋白，GAPs，GEFs等现有产品的药物筛选服务。