Chondrex超全的胶原蛋白诱导小鼠关节炎模型研究方案

小鼠胶原蛋白诱发性关节炎(Collagen induced arthritis, CIA)与人类类风湿关节炎具有共同的免疫学和病理学特征。因此CIA模型被广泛应用于研究致病机理和治疗方案的研究。尽管该模型具有高度可重复性，但要成功诱导高发病率和严重程度的关节炎，一些影响造模的因素需要考虑。

1. 影响造模的因素

a. 动物来源:即使来自不同供应商的同样品系的小鼠也可能会造成实验结果的差异，建议开展实验前先测试不同供应商提供的小鼠。

b. 饲养条件和饮食：为避免细菌和病毒感染在实验中引起的差异，建议在无特定病原体(SPF级)条件下饲养动物。一般来说，对于肠道菌群，不管是否致病都显著影响宿主对抗原的免疫应答。例如，对于感染肝炎病毒（MHV）的小鼠，胶原蛋白不能诱发关节炎。饮食也会影响关节炎的发病率和严重程度，CIA在饲喂不同饲料的小鼠中差异很大。饲喂高脂肪的食物更容易引起高发病率关节炎。

c. 小鼠年龄和品系：建议使用具有成熟免疫系统的7-8周龄的小鼠。老龄小鼠可能对CIA的易感性较差。建议在重复实验中使用相同周龄的小鼠。小鼠对CIA的易感性与 MHC-II 类分子相关， 同时也取决于接种二型胶原蛋白的小鼠品系。DBA/1(H-2^q)和B10.RIII(H-2^r)品系的小鼠被广泛应用，因为这两个品系对CIA高度易感。DBA/1(H-2^q )小鼠，对鸡，牛和猪的二型胶原有免疫应答。B10.RIII小鼠对牛和猪二型胶原有免疫应答，但对鸡二型胶原的免疫应答较弱。DBA/1(H-2^q)和B10.RIII(H-2^r)两种品系小鼠对小鼠的二型胶原蛋白免疫应答较弱，关节炎发生率低于10%。另一方面，CIA抗性的小鼠也可能产生关节炎抗体。 表明小鼠对CIA的敏感性不仅取决于MHC类型。研究表明，CIA抗性的小鼠C57BL/6,129/Sv(H-2^b)和Balb/c(H-2^d)，当INF-g和IL-10基因敲除后，小鼠能产生关节炎自身抗体从而发生关节炎。这表明，对关节炎的敏感性也取决于不同细胞因子水平。下表为用于CIA及抗胶原蛋白抗体诱导（CAIA）的关节炎动物模型研究的常用小鼠品系。

备注： *需要含高剂量结核杆菌的完全弗式佐剂诱导关节炎，（）—假设，没有测试

d. 佐剂：含有结核杆菌的完全弗式佐剂对于诱发小鼠关节炎很重要。不同于大鼠，二型胶原加不完全弗式佐剂（不含结核杆菌）无法诱导小鼠关节炎。强烈的抗体反应以及正确的抗体亚型对于诱导小鼠关节炎至关重要。抗体的产生取决于完全弗式佐剂中结核分枝杆菌的浓度，足够的抗胶原IgG2a和IgG2b亚型抗体水平是激活补体所必需的，这是诱导关节炎的必要步骤。最近， Campbell等人用完全弗式佐剂（5mg/ml）在对CIA 抗性的小鼠中成功诱发高发病率的关节炎（50-70%），例如：C57BL/6, B10, and 129/Sv mice (H-2b)（10）。然而含高浓度结核杆菌的完全弗式佐剂会诱发严重的炎症， 所以佐剂浓度（结核杆菌含量）取决于各研究单位动物管理委员会要求。

e. 胶原蛋白：因为去糖基化的胶原会影响关节炎的产生，同时一些未去除的杂质（比如：胃蛋白酶）可能会导致T细胞刺激试验中产生假阳性，因此二型胶原应按规定高度纯化。冻干的胶原在-20℃避光保存的条件下是非常稳定的。纯化的胶原溶于0.05M浓度的醋酸(Cat#9075)中，终浓度为 2-4mg/ml，温和搅拌，4℃过夜。胶原溶液可在4℃保存一周，此后需在-20℃保存。Chondrex 提供较完整的不同免疫级别二型胶原。备注：DBA/1小鼠对鸡或者牛的二型胶原蛋白有较强的免疫反应，C57B/6小鼠只对鸡的二型胶原蛋白有免疫反应。

2. 胶原蛋白诱导小鼠关节炎实验方案

a. 乳剂制备:乳剂的质量对于诱发关节炎至关重要。乳剂的制备有多种方法。但是不推荐双注射器或超声波处理的方法。这些方法将导致乳剂不能够有效的、稳定的诱发关节炎。此外，超声处理方法将胶原至少分成2个片段，这些小片段在正常体温下，很容易变性。推荐使用电动的高速搅拌器：

(1) 用高速搅拌器 (图1)（带直径≤5mm 的刀片，图2a）搅拌完全佐剂CFA (或用于增强剂注射的不完全佐剂（IFA）)和胶原溶液。将注射器尖端用三通阀封闭 (图2b)。把注射器夹紧，固定在铁架台上， 并冰浴 (图3)。最后一步很重要，因在搅拌过程中会发热，会引起蛋白变性，变性的蛋白不能够诱发关节炎（CIA）。

图1. 高速搅拌器	图2. (a) 搅拌器刀片-直径0.5cm(b)带三通阀的注射器（c）玻璃注射器	图3. 带三通阀的注射器固定在支架上，冰浴

（2）加1体积（最多不超过注射器的25%）完全弗式佐剂（不完全弗式佐剂在加强免疫时用到）到注射器，再缓慢加入等体积的胶原溶液（0.05M 醋酸溶解的的胶原溶液，终浓度为 2mg/ml），边低速搅拌（1000-3000rpm）边滴入胶原溶液。注意：为保证高质量的免疫乳剂，一次量乳剂体积应不得超过注射器体积的50%。如果需要多量生产，可重复以上步骤。

（3）继续高速混合（10,000–30,000rpm）2分钟。冷却5分钟，再重复高速混合和冷却步骤2-3次直到产生稳定的乳液。对于较大的体积（2-5ml），为了使乳液混合均匀，建议在混匀过程中上下移动搅拌刀片。

（4）用针头替换三通阀，在装有冰水的烧杯里滴一滴乳剂，检测乳剂的稳定性。如果乳剂是稳定的， 如图所示（图4），在水中是成团的，不散开。如果乳剂在水中散开，表明乳剂不稳定，再加几滴佐剂，重新混合再次进行测试。

图4.完整稳定的乳剂漂浮在水面

（5）将乳剂转移到1ml的玻璃注射器 （图2C），不建议采用塑料注射器，因为很难做到一个准确的注射剂量。备注：通过用力甩注射器将乳剂中的气泡赶出注射器（活塞部向下）。否则很难做到一个精确的注射剂量；建议在乳剂制备好的1小时内完成注射。乳剂在使用之前存放在4℃。

b. 免疫注射部位:在鼠尾根部皮下注射0.1ml乳剂(100ug胶原每只老鼠 （图5）。例如：从尾根部2cm处插入针头（25号或者27号针头，长度5/8英尺，针插入皮下，针头沿斜向 上与鼠尾方向平行插入，直到针尖插入位置距尾根部0.5cm。每次注射前充分擦拭针头，防止乳液的露出。如果要加强免疫，注射部位在尾根部 3cm 处，针尖插入皮下距鼠尾根部1.5cm处。加强免疫的注射部位应避开初始注射部位）。备注: Chondrex不建议使用背部皮下注射注射或腹腔注射胶原乳剂和佐剂，因为乳剂会引起腹腔和胸腔严重的炎症反应。

图5. 皮下注射乳剂

c. 免疫程序: 根据小鼠品系和实验目的的不同，诱导高发病率和严重关节炎的方法也各有不同。

(1) 通过单次免疫（无需加强免疫）诱发关节炎（易感品系）:注射胶原和完全弗式佐剂混合而成的含2mg/ml结合杆菌乳剂。对于易感品系小鼠DBA/1（H-2^q）和 B10.RIII(H-2^r )注射乳剂后28-35天会引发关节炎。42- 56天发病率达90-100%。关节炎严重程度高，临床评分达10-12分（最高16分）。备注：由于高浓度的结核杆菌会引起免疫部位严重的炎症反应，因此根据各研究机构对动物实验的要求，可选用方案（2）或方案（4）。

(2) 通过加强免疫诱发关节炎（易感品系）：注射胶原和完全弗式佐剂混合而成的含0.5mg/ml结合杆菌乳。在初次注射后第21天，加强注射胶原和不完全弗式佐剂（不含结核杆菌）混合而成的乳剂。尾部皮下注射0.1ml乳剂，避开初次免疫部位。一般在初次免疫注射后28-35天引发关节炎。在第42-56天，发病率为80-100%，临床评分可达8-12分（最高16分）。

(3) 用高剂量的结核杆菌完全佐剂加强免疫诱发关节炎（CIA抗性小鼠）：对于一些低反应的小鼠，例如：B10 (H-2^b ), C57BL/6 (H-2^b ), and C57BL/6x129/Sv (H-2^b) ，采用以下方案可诱发关节炎。初次免疫，尾部皮下注射0.1ml胶原和完 全佐剂混合而成的含2.5mg/ml结核杆菌的乳剂。在第21天加强免疫，再次注射0.1ml胶原和完全佐剂混合而成的含2.5mg/ml结核杆菌的乳剂。一般在初次免疫注射后28-35天引发关节炎。在第42-56天，发病率为50-70%。备注：该方案引起的炎症反应比较严重，根据各研究机构对动物实验的要求，可选用胶原抗体（CAIA） 诱发的小鼠关节炎模型。Chondrex公司的单克隆抗体合剂（Arthrogen-CIA）和LPS能在CIA抗性的小鼠中诱发关节炎。

(4) 通过LPS加强免疫：LPS和体内二型胶原自身抗体水平对于诱发关节炎具有协同效应(13)。此外，在经典的CIA动物模型中，应用LPS(B细胞分裂素)或关节炎支原体(支原体产生的T细胞分裂素)(MAM)或葡萄球菌B型肠毒素(金黄色葡萄球菌产生的T 细胞分裂素)(SEB)都会加强关节炎发病率和严重程度。因此这些毒素不仅用于引发和加强关节炎水平，而且用于指定关节炎发生时间。这个方案，需要注射0.1ml二型胶原和含0.5mg/ml的CFA混合乳剂（参考方案(2)）。在第25-28天或在关节炎发生前3-5天腹腔注射LPS(25-50ug，溶解在生理盐水)。关节炎将在24-48小时发生，发病率90-100%。备注：CFA免疫注射小鼠会在2-4周发生严重的免疫抑制。所以一些小鼠对LPS（50ug）注射非常敏感。 Chondrex建议进行正式实验之前先对来自不同供应商的动物进行测试。

d.关节炎的发作:有效的免疫注射后，临床上明显的关节肿胀症状会在3-5周出现。关节炎的发作和发病率取决于小鼠品系和实验方案。