快速内切酶EcoRV，快速DNA消化方案

FlyCut? 酶是一系列能够快速消化DNA的工程限制性酶。所有FlyCut?酶在通用CutOne中显示出优异的活性? 和CutOne? 彩色缓冲液，能够在5~15分钟内消化DNA。这使得任何限制性酶的组合都能在一个反应管中同时工作，并消除了连续消化的需要。FlyCut? 酶已通过多项严格的质量控制，可用于消化质粒、基因组和病毒DNA以及PCR产物。CutOne? Color Buffer包括密度试剂以及红色和黄色跟踪染料，可以将反应混合物直接装载在凝胶上。CutOne的红色染料? 彩色缓冲液在1%琼脂糖凝胶中与2.5kb双链DNA片段一起迁移，黄色染料在1%琼脂凝胶中与10bp双链DNA碎片一起迁移。

艾美捷快速内切酶EcoRV：

Cat #: C-BSM537

Size: 200 rxns

Storage: -20°C

快速内切酶EcoRV组分：

推荐反应条件

1x CutOne“”缓冲器；在37°C下培养；有关反应设置，请参阅“快速DNA消化方案”。

热灭活

在80°C下培养20分钟。

质量控制

功能测试

在含有1μgλDNA和1μl FlyCut“”EcoRV的CutOne“缓冲液中，在37°C下孵育15分钟，20μl反应可通过琼脂糖凝胶电泳确定完全消化。

长时间培养/星形活性测定

在含有1μgλDNA和1μl FlyCut“EcoRV的CutOne”缓冲液中，在37℃下孵育3小时，反应20μl，琼脂糖凝胶电泳检测到DNA模式没有可检测的核酸酶降解。长期孵育可能导致星形活性。

结扎和清算

在37℃下用FlyCut’“”EcoRV消化10倍后，在22°C下可将>95%的DNA片段与T4 DNA配体连接。在这些连接的片段中，通过琼脂糖凝胶电泳测定，>95%可以用FlyCut“”EcoRV重新切割。

非特异性核酸内切酶活性

在含有1μg超螺旋质粒和1μl FlyCut“”EcoRV的CutOne“缓冲液中，在37℃培养4小时，进行20μl反应，通过琼脂糖凝胶电泳测定，转化为刻痕或线性形式的转化率<10%。

蓝/白筛选试验

用1μl FlyCut消化含有lacZα基因的合适载体? EcoRV。将消化产物连接并转化为大肠杆菌感受态细胞。在含有X-Gal、IPTG和适当抗生素的Luria Bertani培养板上，成功连接的β-半乳糖苷酶基因可以表达并产生蓝色菌落，而中断基因（即降解的DNA末端）产生白色菌落。FlyCut? 限制性内切酶必须产生少于1%的白色菌落。

在推荐的反应条件下，该酶可在5~15分钟内消化单位底物。酶的zui适反应温度为37℃。

当底物DNA被CpG甲基化酶甲基化时，这种限制性酶的切割可能被阻断或受损。

当底物DNA被EcoBI甲基化酶甲基化时，这种限制性酶的切割可能被阻断或受损。

该酶可以在80°C下孵育20分钟进行热灭活。孵育3小时不会显示星形活性，但孵育时间较长可能会导致星形活性。

快速DNA消化方案：

① 按照指示的顺序在冰上混合下列反应组分

Plasmid DNA    PCR product    Genomic DNA

ddH?O    15μl   16μl    30μl

10x CutOne' Buffer or 10xCutOne Color Buffer2μl    3μl?    5μl

DNA    2μl(up to 1μg)   10μ(～0.2μg)    10μl(5μg)

FlyCut" EcoRV 1μl   1μl    5μl

Total    20μl   30μl    50μl

对于纯化的PCR产物。如果PCR产物未纯化，则10×CutOne的量? 缓冲液应减少到2μl，以减少未纯化的PCR产物中剩余的金属离子。我们建议在消化前纯化PCR产物，将其用于克隆，因为一些DNA聚合酶的核酸外切酶活性可能会改变切割DNA的末端

② 轻轻混合并向下旋转；

③ 在37°C下培养15分钟（质粒DNA）或15～30分钟（PCR产物）或30～60分钟（基因组DNA）；

④可选：在80°C下加热20分钟使酶失活；

⑤如果CutOne? 在反应中使用颜色缓冲液，将反应混合物的等分试样直接装入凝胶中。

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