快速T4 DNA连接酶质量控制&使用说明

快速T4 DNA连接酶由携带T4噬菌体基因30的大肠杆菌产生。这种酶催化双链DNA或RNA的5'-磷酸基团和3'-羟基之间形成磷酸二酯键。它可以修复双链DNA、RNA或DNA/RNA杂交体中的单链缺口，并可以用粘性或钝端连接DNA片段。然而，它对单链核酸没有活性。主要用于酶切DNA片段的克隆、定点诱变、PCR产物的克隆和双链DNA缺口的修复。快速T4 DNA连接酶需要ATP作为辅助因子，在室温下仅需10分钟即可完成粘性末端连接反应

艾美捷快速T4 DNA连接酶：

Cat #: C-BSM205

Size: 1000 U

Storage: -20°C

酶活性定义：

在37°C下，1个Weiss单位的酶在20分钟内催化1 nmol[32PPi]转化为吸附的活性碳。1 Weiss单元相当于大约200个内聚末端连接单元（CEU），这类似于在16°C下30分钟内连接50%HindIII消化的λDNA片段。

质量控制

残余核酸内切酶活性检测：

在37℃下，将200U的Fast T4 DNA连接酶与1μg的pUC19 DNA孵育4小时。未检测到从共价环状DNA到刻痕DNA的转化。

残留核酸外切酶活性检测：

将酶溶液与双链DNA底物在37℃下孵育16小时。在

用DNA凝胶电泳法检测双链DNA底物。

蓝色/白色屏幕：

在室温下，将pUC57 DNA/HindII、pUC57 DNA/Pstl或pUC57脱氧核糖核酸/Smal消化产物与30U快速T4脱氧核糖核酸连接酶孵育1小时。然后将连接产物转化为有能力的大肠杆菌XL1Blue细胞。Lessthan1%的白色菌落被检测到。

快速T4 DNA连接酶使用说明：

1.DNA插入片段与载体DNA的连接（粘性末端连接）：

① 在冰上制备以下反应混合物：

② 充分混合并短暂离心，然后在22°C下孵育10分钟。

③ 取1-5μl连接产物转化50μl化学活性细胞，或取1-2μl转化50μl电活性细胞。

注：如果连接产物用于电穿孔，则使用柱纯化或氯仿提取来清洁DNA，而不是热灭活步骤。

2.DNA插入片段与载体DNA的连接（钝端连接）

3.线性DNA自环化

4.适配器结扎

双链寡核苷酸适配器通常用于在插入片段上产生粘性末端。它们通常含有限制性内切酶识别位点，在连接和酶消化后，这些位点与克隆载体产生相容的末端。有时适配器已经包含与克隆载体兼容的粘性末端，从而消除了在适配器连接后对插入片段进行进一步处理的需要

备注：

快速T4 DNA连接酶被高于200mM的NaCl或KCl浓度强烈抑制。

连接反应混合物的量不应超过感受态细胞体积的10%，系统中不建议使用过量的Fast T4 DNA连接酶。

与快速T4 DNA连接酶结合的DNA可能在琼脂糖凝胶上表现出带转移或涂抹。为了避免这种情况

在这种现象下，可以在装载前对酶进行热灭活，如有必要，可以加入适量的SDS。

聚乙二醇（PEG）显著提高了钝端结扎的效率。PEG 8000的推荐浓度为连接混合物的5%（w/v）。

电穿孔效率可以通过快速T4 DNA连接酶的热失活或通过使用柱纯化或氯仿提取进行DNA纯化来提高。转化体的数量可以通过将反应时间延长到1小时来增加。

该试剂仅用于科学研究领域，不适用于临床诊断或其他用途。

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