快速多片段DNA无缝克隆预混液工作流程&使用原理

基于重组原理的无缝克隆技术是一种新一代的克隆方法，不需要繁琐的酶消化、连接步骤或末端抛光。它允许通过将DNA片段与线性化载体末端的15~25nt同源序列重组，将插入片段克隆到线性化载体的任何位置。该载体的自连接背景极低，是一种简单、快速、高效的DNA定向克隆技术。FlyCut? DNA组装Mix-Plus无缝克隆试剂盒能够在单个反应中重组单个或多个DNA片段。它可以在5分钟内实现单片段重组，阳性率超过95%。添加到混合物中的辅助因子有效地提高了克隆阳性率，优化的反应系统可以在一定程度上耐受未纯化的PCR产物中的杂质。无血清克隆试剂盒的升级版具有更高的阳性率和更好的兼容性。

艾美捷快速多片段DNA无缝克隆预混液：

Cat #: C-BSM1202

Size: 50 rxns

Storage: -20°C

快速多片段DNA无缝克隆预混液：

组件   规格

FlyCut“DNA组装混合物+250μl

pUC19对照质粒，线性化（安培，40纳克/μl）50μl

500 bp对照片段（20纳克/μl）50μl

快速多片段DNA无缝克隆预混液使用说明：

1.工作流程概述

2.线性化克隆载体的制备

选择合适的克隆位点并将载体线性化。载体的线性化可以通过酶切或反向PCR扩增来实现。

① 酶消化制剂

一些限制性内切酶不能有效地消化超螺旋DNA，这可能导致不同数量的载体DNA未消化，导致阳性率降低。建议使用FlyCutTM快速限制酶进行消化（单次或双次消化），以确保载体的完全线性化并减少转化背景（从未消化的载体中获得假阳性克隆）。

注1：通过酶消化制备的线性化载体不需要去磷酸化。建议进行双重消化。

注2：消化后，建议灭活限制性内切酶或纯化所需产物，用于组合反应。

② 反向PCR扩增制备

为了尽量减少扩增突变的引入，建议使用高保真度PCR混合物进行扩增。建议使用预线性化的质粒作为模板，以减少残留的环状质粒模板对克隆阳性率的影响。

注1：如果PCR产物没有显示出特定的条带，建议使用模板消除剂消化质粒模板，用于重组反应。否则，建议对PCR产物进行纯化。

注2：对于多片段克隆，建议在使用前对PCR产物进行纯化。

3.插入片段的PCR引物的设计

PCR引物的5'端必须包含与相邻片段（插入片段或载体）端同源的15~25nt（推荐18nt）序列。如果矢量有粘性末端，并且3'末端突出，则底漆设计必须包括突出部分。如果5’端突出，底漆设计可以包括或排除突出部分。插入片段的正向扩增引物：

5'-上游载体同源序列+限制性位点（可选）+基因特异性正向扩增

序列-3'

插入片段的反向扩增引物：

3'-基因特异性反向扩增序列+限制性位点（可选）+下游同源载体

序列-5'

注1：建议选择没有重复序列、GC含量一致的区域进行克隆。当载体克隆位点上游和下游的25nt区域中的GC含量在40%和60%之间时，实现了较高的重组效率。

4.插入片段的PCR扩增

建议使用高保真度PCR混合物，以尽量减少扩增突变的引入。建议使用纯化的PCR产物进行无缝克隆反应。如果通过琼脂糖凝胶电泳将PCR产物鉴定为特异性扩增产物，则可以直接使用，但添加的体积不应超过总反应体积的20%。

5.重组反应

6.重组产品的转化

取5-10μl反应混合物，加入100μl感受态细胞中。轻轻移液管并缓慢混合，然后放在冰上30分钟。在42°C下加热休克45-60秒，然后在冰上孵育5分钟。加入500μl SOC或LB培养基，在37℃下振荡40-60分钟（200 rpm）。将细菌溶液均匀地涂抹在含有相应抗生素的琼脂板上，并在37°C下孵育过夜。

7.阳性克隆检测：

取单个菌落与10μl ddH20混合。在95°C下孵育10分钟进行裂解后，取1μl裂解液作为平板进行菌落PCR鉴定。或者，将单个菌落接种在含有抗生素的培养基中并培养过夜，然后提取质粒进行酶消化鉴定。对于阳性克隆检测中的阳性对照，使用通用引物M13F和M13R进行克隆PCR，使用Hindll和EcoRI进行酶消化鉴定。

注1：建议在菌落PCR中至少使用一种通用引物，以避免假阳性结果。

注2：如有必要，可对阳性结果进行进一步测序鉴定。

Biogradetech全球生命科学和医药研发行业关键原料与试剂的领先供应商：Biogradetech成立于2015年，总部位于美国加利福尼亚州，早期以产品技术研发服务起家，逐步发展了广泛的产品线，并将其商业化销售，包括蛋白质、抗体、酶、培养基、试剂盒和仪器。适用于细胞生物学、蛋白质组学、分子生物学、免疫学、微生物学、诊断学、生物化学、神经科学、血液分析和高通量药物筛选等领域。