TheWell Bioscience--基于水凝胶的3D细胞模型的自动化分配、监测和分析开发

【介绍】

代表各种微环境的3D细胞模型对于准确的药物筛选和疾病建模至关重要。这些模型可以作为体外和体内模型，用于进行高通量、成本效益高的分析，这对于发现生物学相关的治疗方法至关重要。为了在药物发现研究和筛选中更广泛地采用3D模型，并使过程更简单，对高通量筛选和自动化处理的需求日益增加，以显著降低成本时间。 Advanced Solutions的BioAssemblyBot 400（BAB400）是一种cGMP认证的多工具设备，可用于建立复杂的生物模型。作为一个多功能平台，它可用于构建模型，其气动分配和3D打印能力使其能够构建和处理不同的3D模型或类器官而不受损坏。其液体处理工具可有效地将规定数量的细胞分配在水凝胶、Matrigel 或其他合适的细胞外基质中到多孔板中。

【优势】

整合3D细胞模型的开发、维护和成像的工作流程

易使用且cGMP认证的界面，便于BioAssemblyBot 400和ImageXpress 成像仪组合之间的轻松集成和操作

温度无关、无外源成分的基质 ，用于3D细胞模型高通量分析

通过自动化的BAB400和ImageXpress Micro Confocal高内涵成像系统（IXM - C）改进您的3D细胞模型的高通量、高内涵成像分析

在这项工作中，我们使用VitroGel 基质以96孔打印细胞的3D细胞结构。TheWell Bioscience的VitroGel是一种可调节、无外源成分（无动物源）的生物功能水凝胶系统，允许最大程度的灵活性来操纵3D细胞培养环境。它与温度无关，是动物源性细胞外基质（如Matrigel）的极佳替代品，并且可以支持广泛的细胞类型和最终结构要求。VitroGel独特的剪切稀化和快速恢复流变特性使其在分配后能够实现出色的细胞分布，并使其与自动化液体处理系统极易使用。 在这项工作中，我们使用患者来源的三阴性乳腺癌细胞（引用）与VitroGel基质混合，通过生物打印在96孔创建3D培养物，可用于观察细胞生长作为3D肿瘤球体以及评估药物的效果。 我们提出了一种使用VitroGel在集成系统中用于3D细胞模型的工作流程，以进行分配、监测、进行药物筛选分析以及成像和分析数据。该系统包括BAB400和ImageXpress Micro Confocal系统（图1）。

【方法】

用于球体的VitroGel和细胞悬液 

4IC细胞 在添加了葡萄糖、NEAA、2mM谷氨酰胺和120μg/L胰岛素、10％FBS（Gibco 12491 - 015）的高级DMEM中培养。对于分析，球体在DMEM + 10％透析血清（2mM谷氨酰胺，5mM葡萄糖，无酚红）中培养。 使用胰蛋白酶收获患者来源的三阴性乳腺癌细胞，并将其悬浮在含有30％FBS的培养基中，浓度为5×10⁵细胞/mL。3D细胞培养在VitroGel水凝胶基质（SKU：VHM01）中进行，步骤如下：

1.将VitroGel水凝胶基质置于室温或加热至37°C。

2.将水凝胶溶液和细胞悬浮液以2:1 (v/v)的比例混合。

3.在96孔板的每孔中加入10 μL水凝胶-细胞混合物(非组织培养处理)

4.在室温下等待10-15分钟形成水凝胶。在地层过程中，不要倾斜或晃动孔板，以免影响水凝胶。

5.在水凝胶上仔细加入90 μL细胞培养基。

6将孔板置于培养箱中，每隔一天更换一次培养基。

BioAssemblyBot 400用于分配(移液器工具)，介质交换，药物筛选，活死分析BioAssemblyBot 400 BAB400提供了一个带有HEPA气流系统的无菌环境。

在使用前至少一小时（最好过夜），喷洒并擦拭除工具和任何电子设备以外的表面，并打开HEPA过滤器功能。使用BAB400的HMI和操纵杆控制器，可以为各种步骤设计不同的路径。使用控制台记录储液器、板、管、垃圾等的坐标，为每个所需的工作流程设置路径。VitroGel中的培养基和细胞悬液事先在BAB400中准备好并转移到储液器中。

图1. 集成系统工作流程的示意图[BAB自动分配和IXM - C成像] 夹持器（PnP工具）序列可用于开盖和盖盖板，并在使用BAB400完成分配后将板移动到ImageXpress Micro Confocal系统进行成像。BAB400可以选择在无人干预的情况下运行多步骤过程。

通过将自定义实验方案结合在一起以构建3D细胞模型，实验可以转化为自动化工作流程。BioApps  Maker是一种易于制作和自动化的解决方案，用于自动化3D模型的独立分配、维护和成像的一系列步骤。 例如，涉及的水凝胶分配序列步骤如下： 获取吸头→移液器工具移动到水凝胶储液器→向下（进入储液器）→混合Y次（以定义的速度吸取然后分配）→移动到板（左/右/方向 - 然后孔中心）→分配（定义体积和分配速度）→将吸头丢弃（到BAB400中的生物危害袋中）。可以为培养基吸取和分配设计类似的路径 - 吸头到达孔的边缘以保持VitroGel圆顶完整。含有选择药物和Live / dead染色剂的培养基也可用于球体的进一步处理和成像分析。可选步骤：将BAB400的温度控制阶段预冷却至10°C，以加快96孔中分配的VitroGel液滴的凝胶化。 ImageXpress Micro Confocal成像和分析 在BAB400将微孔板移动到ImageXpress Micro Confocal成像仪（Molecular Devices）后，使用MetaXpress 高内涵图像采集和分析软件获取透射光（TL）或荧光图像。使用共聚焦模式，使用4X或10X物镜获取球体的Z堆栈图像。所有分析均使用MetaXpress图像分析软件进行。BioApps 可以提取并执行特定序列或实验的正确预选成像采集和分析文件。

【结果】 

通过BAB400和手动操作，在多个96孔板中接种了4IC乳腺癌细胞在VitroGel圆顶中。在第3天使用Cyto3D Live - Dead Assay Kit（TheWell Bioscience，SKU：BM01）染色进行活死计数观察，并使用上述成像方法进行分析。活死分析用于计算活细胞和死细胞。显然，手动接种或自动接种的细胞之间的细胞活力没有显著差异。BAB400工作流程的平均活力为93％，而手动分配的孔板的活力为92.4％（图2）。因此，自动化细胞打印不影响细胞活力。

图2. A. BAB ；B. 手动分配的VitroGel和三阴性乳腺癌细胞（4IC）用Cyto3D染色（绿色 - 活，红色 - 死），并在第3天使用IXM - C成像。使用MetaXpress软件分析相同数据的图形表示（C.）。

为了测试药物治疗的工作流程，在第3天向多孔板中加入药物Trametinib和Idarubicin，使其最终浓度达到4μM，并在治疗48小时后的第5天评估其效果。与对照相比，我们观察到两种药物治疗中细胞活力均显著降低（图3）。如上述所述，用活力染料染色后，通过成像方法确定细胞活力。在4μM Idarubicin中，死细胞百分比最高，球体中97％的细胞死亡，而在Trametinib的情况下为66.4％，对照为7.5％（图3）。

 图3. 细胞用BAB分配（VitroGel和三阴性乳腺癌细胞（4IC））。对照（A）和处理样品用Cyto3D（绿色 - 活，红色 - 死）和DAPI（蓝色 - 核）染色，处理 - 用Trametinib（B）和Idarubicin（C）在4μM浓度下处理48小时。这些在第5天使用IXM - C成像。使用MetaXpress软件分析相同数据的图形表示（D）。

【结论】

通过将 BAB400 和 ImageXpress Micro Confocal 成像仪与易于处理和可调节的 ECM 基质（VitroGel）集成，用于 2D/3D 细胞培养、3D 细胞模型的维护和分化，可实现 3D 细胞模型工作流程的自动化，该模型可用于化合物筛选和各种分析。这将通过节省时间和成本并减少重复步骤，有效地促进正在进行的基础、药理和生物医学研究以及产品开发。

【参考】

Cromwell EF, Sirenko O, Nikolov E, Hammer M, Brock CK, Matossian MD, Alzoubi MS, Collins - Burow BM, Burow ME. Multifunctional profiling of triple - negative breast cancer patient - derived tumoroids for disease modeling, SLAS Discovery 2022, 27(3): 191–200., https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35124274/