GSK3α检测试剂盒检测协议说明

GSK3α检测试剂盒旨在使用Kinase-Glo?（Promega）作为检测试剂，用于筛选和分析GSK3α活性的应用。GSK3α检测试剂盒以方便的96孔格式提供，包含足够的纯化的重组GSK3α酶、GSK3α底物（GSK底物肽）、ATP和激酶检测缓冲液，可供进行100次酶反应。

艾美捷GSK3α检测试剂盒（BPS-79698）组成：

Reagent Amount Storage

GSK3a* 1.5μg -80℃

5x Kinase assay buffer 1.5 ml -20°℃

ATP (500 μM) 100μ -20℃

1 mg/ml GSK substrate peptide 500μ -20℃

96-well plate,white   1 Room Temp.

*GSK3α的浓度具有批次特异性，将在含有酶的试管上显示

材料或仪器需求但未提供：

Kinase-Glo? Max 检测试剂盒（Promega #V6071）、二硫苏糖醇（DTT，1M；可选）、能够读取化学发光的微孔板阅读器、可调节的微量移液器和无菌吸头、30°C 恒温箱。

应用：适用于研究酶动力学和筛选小分子抑制剂，用于药物发现和高通量筛选（HTS）应用。

稳定性：按照推荐的存储条件，可保存长达6个月。

禁忌：保持Z终DMSO浓度低于1%。

参考文献：McCubrey JA., 等人，Oncotarget 5(10): 2881-2911 (2014)。

GSK3α检测试剂盒检测协议：

所有样品和对照应成对测试。

1、解冻5倍浓缩的激酶检测缓冲液、ATP和1 mg/ml GSK底物肽。（可选：如果需要，向5倍浓缩的激酶检测缓冲液中添加DTT，使其浓度达到10 mM；例如，向1 ml 5倍浓缩的激酶检测缓冲液中添加10 ?l的1M DTT。只准备检测所需的5倍浓缩的激酶检测缓冲液/DTT，因为任何多余的5倍激酶缓冲液/DTT不能存储，应当丢弃。）

2、准备母液（每孔25 ?l）：N孔 x (5 μl 5倍浓缩的激酶检测缓冲液 + 1 ?l ATP（500 ?M）+ 5 ?l 1 mg/ml GSK底物肽 + 14 μl蒸馏水)。向每个孔中加入25 μl。

3、在水基溶液中准备10倍浓缩的抑制剂。注意：Z终DMSO浓度必须 ≤1%。更高的DMSO水平可以显著降低酶活性。例如，要测试以100% DMSO溶解的10 ?M抑制剂，用水将1 mM抑制剂稀释，制成10% DMSO中的100 ?M抑制剂溶液（水溶液）。然后，向检测中添加5 ?l的100 ?M溶液，使Z终反应混合物中的DMSO浓度为1%。

4、向标记为“测试抑制剂”的每个孔中添加5 μl的抑制剂溶液。对于“阳性对照”和“空白”，添加5 μl的10% DMSO水溶液（抑制剂缓冲液）。

5、准备3 ml的1倍浓缩的激酶检测缓冲液，将600 ?l的5倍浓缩的激酶检测缓冲液与2400 ?l的水混合。（3 ml的1倍浓缩的激酶检测缓冲液足够100次反应。）只稀释检测所需的5倍激酶检测缓冲液；丢弃剩余的1倍激酶检测缓冲液。

6、向标记为“空白”的孔中加入20 μl的1倍浓缩的激酶检测缓冲液。

7、在冰上解冻GSK3α酶。首次解冻时，短暂离心含有酶的管子以恢复管内全部内容物。计算检测所需的GSK3α量，并用1倍浓缩的激酶检测缓冲液将酶稀释至约0.6 ng/?l。将剩余未稀释的酶分装后在-80°C下保存。注意：GSK3α酶对冻融循环敏感。避免多次冻融循环。不要重复使用已解冻的小瓶或稀释后的酶。

8、通过向标记为“阳性对照”和“测试抑制剂对照”的孔中添加20 ?l稀释后的GSK3α酶来启动反应。仔细摇动板子并在30°C下孵化45分钟。

9、解冻Kinase-Glo Max试剂。

10、45分钟反应后，向每个孔中添加50 ?l的Kinase-Glo Max试剂。用铝箔覆盖板子并在室温下孵化15分钟。

11、使用微孔板阅读器测量化学发光。应从所有孔中减去“空白”值。