Cell文献解读-NFAT荧光素酶信号检测（货号60690），评估肽段激活PD-1抑制T细胞的能力

癌症免疫逃逸是癌症发展的重要机制之一，而程序性死亡蛋白1（PD-1）及其配体PD-L1在癌症免疫逃逸中扮演了关键角色。PD-1是T细胞表面的一种抑制性受体，通过与PD-L1结合，抑制T细胞的活化，从而帮助肿瘤细胞逃避免疫系统的攻击。基于这一机制，阻断PD-1和PD-L1的相互作用已成为癌症免疫治疗的重要手段。目前，临床上广泛使用的PD-1/PD-L1阻断疗法主要是基于单克隆抗体的药物，如派姆单抗（Pembrolizumab）和纳武单抗（Nivolumab）。尽管这些抗体药物在某些类型的癌症治疗中取得了显著疗效，但高昂的生产成本、潜在的免疫相关不良事件以及在某些癌症类型中的疗效有限，促使研究者们寻找新的替代疗法。

“Peptide Blockers of PD-1-PD-L1 Interaction Reinvigorate PD-1-Suppressed T Cells and Curb Tumor Growth in Mice” 旨在开发一种基于多肽的PD-1/PD-L1阻断剂，作为抗体疗法的替代方案。与传统的抗体疗法相比，肽类抑制剂具有分子量小、生产成本低、免疫原性低以及易于穿透肿瘤组织等优势。此外，肽类抑制剂还可能具有更低的免疫相关毒性。然而，由于肽类分子体积小、易被快速清除和酶解，因此提高其稳定性和体内半衰期是实现其临床应用的关键。

图1：在共培养表达pd -1的Jurkat T细胞（JT-PD1，也表达NFAT荧光素酶报告因子）和表达pd - l1的CHO细胞（CHO- pdl1，也表达TCR激活因子）中，基于NFAT荧光素酶信号，测定了多肽重新激活pd -1抑制T细胞的能力。

实验方法

1. 肽的合成与优化：本研究首先通过固相肽合成技术合成了覆盖PD-1和PD-L1胞外域的重叠肽库。这些肽段长度在16-18个氨基酸之间，具有3-5个氨基酸的重叠。随后，通过功能筛选，即评估这些肽在PD-1表达的Jurkat T细胞（JT-PD1）与PD-L1过表达的CHO细胞（CHO-PDL1）共培养体系中激活T细胞的能力，识别出能够有效阻断PD-1/PD-L1相互作用的肽段。经过多轮筛选和优化，最终确定了一个名为L7N的16肽，该肽段在体外和体内均表现出显著的PD-1/PD-L1阻断活性。为了进一步提高L7N肽的稳定性和体内半衰期，研究团队采用了与白蛋白结合的策略。通过将L7N肽的N端与能够特异性结合白蛋白的棕榈酸标签相连，合成了PA-L7N肽。这种结合不仅提高了肽的稳定性，还有助于肽在体内的循环和分布。

2. 细胞共培养与功能评估：在体外实验中，研究团队采用了两种共培养体系来评估肽的活性。第一种是JT-PD1（PD-1 / NFAT 报告基因 - Jurkat 重组细胞系，货号60535）细胞与CHO-PDL1细胞（PD-L1 / TCR 激活剂 - CHO 重组细胞系 ，货号60536）的共培养体系，通过测量NFAT荧光素酶报告基因的表达来评估肽激活T细胞的能力。NFAT是一种在T细胞激活过程中起关键作用的转录因子，其激活程度可以反映T细胞的活性状态。通过萤光素酶检测试剂（ONE-Step 荧光素酶检测系统，货号60690）测量NFAT荧光素酶信号，能够客观地量化不同肽段对T细胞激活的影响，从而为肽段的筛选和优化提供了可靠的实验依据。第二种是JT-PD1细胞与PD-L1过表达的Raji B细胞（Raji-PDL1）的共培养体系，通过测量IL-2的分泌来评估肽的活性。此外，研究团队还利用人外周血单核细胞（PBMCs）与乳腺癌细胞MDA-MB-231的共培养体系，评估了肽在促进癌细胞杀伤方面的作用。

图2：PD-L1/TCR激活剂CHO重组细胞系的共培养作用机制：存在于PD-L1/TCR激活剂CHO细胞表面的TCR激活剂刺激Jurkat T细胞中的TCR，而CHO细胞系上PD-L1的过度表达会激活Jurkat PD-1，阻断TCR激活信号并阻止NFAT的激活。

3. 动物模型与体内实验：为了验证肽在体内的活性，研究团队采用了4T1同系小鼠乳腺癌模型。在该模型中，小鼠被接种4T1乳腺癌细胞，并在接种后第7天开始每日腹腔注射不同剂量的肽或抗体。通过定期测量肿瘤体积和重量，评估了肽在抑制肿瘤生长方面的作用。此外，研究团队还通过免疫沉淀和免疫印迹实验，检测了肿瘤组织中PD-1和PD-L1的结合情况，以及通过流式细胞术分析了肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）的数量和类型。

实验结果

1. 体外实验结果：在体外实验中，L7N肽在多种共培养体系中均表现出显著的PD-1/PD-L1阻断活性。在JT-PD1/CHO-PDL1共培养体系中，L7N肽能够有效激活被PD-1/PD-L1相互作用抑制的T细胞，其活性甚至优于抗PD-1抗体。在JT-PD1/Raji-PDL1共培养体系中，L7N肽同样能够显著促进T细胞分泌IL-2。此外，在PBMCs与MDA-MB-231细胞的共培养体系中，L7N肽能够显著促进PBMCs对癌细胞的杀伤作用。

2. 动物实验结果：在动物实验中，PA-mL7N肽在4T1同系小鼠乳腺癌模型中表现出显著的抗肿瘤作用。与对照肽和抗体相比，PA-mL7N肽能够显著抑制肿瘤的生长和重量增加。Western blot实验结果显示，PA-mL7N肽能够以剂量依赖的方式阻断肿瘤组织中PD-1和PD-L1的结合。流式细胞术分析显示，PA-mL7N肽能够显著增加肿瘤浸润CD8+T细胞的数量，这表明其抗肿瘤作用可能与促进CD8+T细胞的招募和活化有关。

3. 机制探讨：计算模型预测结果显示，L7N和mL7N肽可能通过与PD-1和/或PD-L1的直接结合来阻断它们的相互作用。此外，研究团队还探讨了L7N肽可能通过影响PD-L1的N-糖基化来间接阻断PD-1/PD-L1相互作用的机制。然而，这些假设需要进一步的实验验证。

在本研究中，萤光素酶检测试剂被用于测量NFAT荧光素酶信号，以评估肽段重新激活PD-1抑制T细胞的能力。NFAT是一种在T细胞激活过程中起关键作用的转录因子，其活性可以通过荧光素酶报告基因检测来量化。通过向共培养体系中加入萤光素酶检测试剂并测量荧光强度，研究者能够快速、准确地评估不同肽段对T细胞激活的影响。

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