BMA Biomedicals 钙粒蛋白 (S100A8/A9, MRP8/14) ELISA 试剂盒的准备事项

替代名称：MRP8：S100A8，Calgranulin A，CP-10（在小鼠中）；MRP14：S100A9，Calgranulin B；Calprotectin：MRP8/14，L1，（p8,14），p34。迁移抑制因子相关蛋白（MRP）-8和-14属于与髓系细胞分化相关的S-100家族钙结合蛋白。它们在静止的中性粒细胞、角质细胞（特别是在银屑病中）、浸润组织巨噬细胞以及活跃炎症性疾病的上皮细胞中高度表达。慢性或急性炎症中巨噬细胞亚群的异质性反映在MRP8和MRP14的不同表达上。表达MRP8和MRP14的吞噬细胞属于早期浸润细胞，而单独的MRP8则在慢性炎症组织中发现。MRP8、MRP14以及Ca2+依赖的MRP8/14异质复合体的部分拮抗功能使它们成为多功能的介质。

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钙粒蛋白 (S100A8/A9, MRP8/14) ELISA 试剂盒功能：

Calprotectin异质复合体的一个主要功能是其抗菌活性。Calprotectin通过与锌的竞争来抑制病原体的生长。它还能诱导某些肿瘤细胞的凋亡。这些活性可被Zn2+和其他二价阳离子所抵消，但不会被Ca2+或Mg2+所抵消。MRP8/14异质复合体特有的另一个重要属性是其作为脂肪酸运输蛋白的独特角色。依赖Ca2+的脂肪酸-MRP8/14复合体是中性粒细胞中多不饱和脂肪酸的主要载体。该复合体在静止细胞中表达，并在受到刺激时移动到膜上。即使在生理浓度的Zn2+下，Zn2+也抑制了MRP8/14的脂肪酸载体能力，因此脂肪酸不在血液循环中运输。这使得MRP8/14成为钙信号和花生四烯酸效应之间的重要介质。MRP8（以及MRP8/14，但不是单独的MRP14）在炎症介质的刺激下分泌。它是中性粒细胞和单核细胞的强效趋化因子。然而，MRP8并不增加细胞内Ca2+，也不诱发像C5a那样的氧化爆发和颗粒酶释放。MRP8暴露于次氯酸盐下，可能由活化的中性粒细胞产生，会将其转化为不活跃的二硫键连接的二聚体。糖皮质激素通过炎症介质上调MRP8的诱导。MRP8可能有助于调节胎儿-母体相互作用，这将解释为什么在小鼠中灭活MRP8基因会导致胚胎致死。MRP14与MRP8在活化的巨噬细胞中不共表达，指向它们不同的作用。MRP14的C末端序列与中性粒细胞固定因子的N末端相同。MRP14可以被磷酸化，这增加了其Ca2+结合能力。然后它倾向于从细胞质转移到膜和细胞骨架。已经证明MRP14与具有转移增强能力的中性粒细胞亚群相关联。

检测原理：

使用一种高度特异性的单克隆抗体作为抗原捕获，以及一种多克隆鸡抗体用于检测的一步非竞争性夹心法检测。试剂限制在辣根过氧化物酶催化的四甲基联苯胺颜色反应中，包括在多孔板阅读器中450/630 nm处的停止反应和读取。

提供的试剂：

S-1011A 即用型预涂覆并稳定的微孔板（Nunc Maxisorb）和板封口器。

S-1011B 1.5 ml的1000 ng/ml标准品，MRP8/14复合体的制剂。用测定缓冲液稀释以获得标准曲线所需的浓度。

S-1011C 50 μl的辣根过氧化物酶偶联的检测抗体。开启前短暂离心以收集所有溶液。

S-1011D 50 ml测定缓冲液（3倍浓缩），一种含有阻断剂和防腐剂的绿色溶液。

S-1011E 1.5 ml四甲基联苯胺（TMB）-H2O2溶液。保持避光。

S-1011F 2×15 ml底物缓冲液（柠檬酸钾）。

试剂盒在原始包装中冷藏保存，自交货之日起稳定6个月。

未提供的物料：停止溶液（1N硫酸，见下文），标准稀释用的塑料管；移液管和带有450 nm滤光片的微孔板阅读器。

准备事项

尝试估计在一个实验中需要的各种溶液的量，并准备实际所需的体积。强烈建议对样品和标准品进行双重测试。让试剂预热至室温，并在使用前立即准备以下稀释液：

测定缓冲液：

用两部分纯化水稀释浓缩的绿色储备溶液S-1011D。示例：向15毫升储备溶液中加入30毫升水。

样品：

将样品分装存放在-20°C或更低温度下。每个分装只使用一次，并在适当稀释的测定缓冲液（S-1011D）中稀释。推荐的稀释比例为：血清或血浆1:100；关节液1:100 - 1:10,000；呼出物、唾液、BAL和尿液1:10。

标准品：

轻轻涡旋1000 ng/ml的Calprotectin（MRP8/14）储备溶液，准备适当稀释如下。储备溶液在4° - 8°C下存放时稳定六个月。

下面的测试程序使用四个标准品，浓度分别为1000、250、62.5和15.63ng/ml，这定义了一个标准曲线，适用于大多数1:100稀释的正常血清。如有必要，调整血清稀释比例以位于曲线的线性部分。

检测试剂（S-1011C）：

将试剂S-1011C用测定缓冲液稀释至1:400。示例：向10毫升测定缓冲液中加入25微升。10毫升足够一个96孔板使用。

底物稀释：

在使用前立即准备。在使用前将底物缓冲液（S-1011F）预热至室温。通过将20部分底物缓冲液与1部分TMB - H2O2溶液（S-1011E）混合来准备稀释液。这个稀释液应在准备后15分钟内使用。

停止溶液：

将硫酸稀释至1N的浓度。示例：向100毫升水中加入2.9毫升95 - 97%的硫酸（按此顺序。不要将水加入酸中）。95 - 97%的浓硫酸（比重1.84）是36N。

BMA Biomedicals是瑞士的一家免疫学试剂制造商，也是提供免疫化学物质的供应商。1989年由免疫学家、生化学家和生物学家创立，主要服务/产品：单克隆和多克隆抗体的生产和衍生化的抗体；以及在炎症、传染病、止血、肿瘤相关疾病等，BMA 的主要专长在于抗体在免疫组织化学和酶免疫测定(ELISA)中的应用，在免疫学技术中的应用。BMA 拥有自己的设施，拥有先进的分析和生产基础设施。专业知识在于单克隆和多克隆抗体的生产和衍生化，以及它们在免疫技术中的应用。

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