Biogradetech 高效组织解离剂：胶原酶，2 型在细胞培养和生物制药领域的应用

粗制胶原酶制剂包含两种不同胶原酶的几种同工酶、一种巯基蛋白酶、氯链蛋白酶、一种类似胰蛋白酶的酶和一种氨肽酶。这种胶原酶和蛋白酶活性的组合在分解细胞间基质方面非常有效，这是组织解离的关键部分。该复合物的一个组成部分是一种水解酶，它优先在天然胶原的螺旋区域中降解，特别是在序列Pro-Y-Gly-Pro中的Y-Gly键，其中YZ常是一种中性氨基酸。这种裂解产生的产品容易进一步被肽酶消化。粗制胶原酶被金属螯合剂如半胱氨酸、EDTA或邻苯二酚抑制，但不被DFP抑制。它也被α2-巨球蛋白，一种大型血浆糖蛋白抑制。酶活性需要Ca2+。每种胶原酶特有的酶谱已与用于研究的细胞来源的组织（或细胞的使用目的）相关联，因此通过相关性已建立了几种类型的粗制胶原酶：类型1、2、3和4。

- 类型1粗制胶原酶具有原始的胶原酶、酪蛋白酶、氯链蛋白酶和胰蛋白酶活性的平衡。

- 类型2含有较高相对水平的蛋白酶活性，特别是氯链蛋白酶。

- 类型3含有Z低水平的次级蛋白酶。

- 类型4设计为特别低的胰蛋白酶活性，以限制对膜蛋白和受体的损伤。

- 类型5含有更高的胶原酶和酪蛋白酶值。

- 类型6含有高胶原酶活性，酪蛋白酶与胶原酶的比例约为2:1。设计为相对于类型I（col G）胶原酶，富含类型II（col H）胶原酶。

- 类型7含有比类型1和2胶原酶高四倍的胶原酶和酪蛋白酶活性。

- 纯化胶原酶，代码：CLSPA，含有Z少的次级蛋白水解活性以及高胶原酶活性。

无动物源类型AFA、AFB和AFC，STZ1和STZ2胶原酶是从完全不含动物成分的培养基中培养出来的，设计用于生物加工应用，其中必须防止潜在的动物源性病原体的引入。次级蛋白酶的水平与类型1和2胶原酶相似。

- CLSAFA是原始的AFA等级，设计为具有与类型1和2胶原酶相似的胶原酶和次级蛋白酶。

- CLSAFB含有比CLSAFA更高的胶原酶和酪蛋白酶活性。

- CLSAFC具有类似于类型4胶原酶的特别低的胰蛋白酶活性。

- CLSAFD含有比CLSAFA高两到三倍的特定活性。

- 纯化胶原酶，代码CLSAFP含有Z少的次级蛋白水解活性以及高胶原酶活性。

- STZ1和STZ2，0.22μ过滤STEMxyme AOF胶原酶/中性蛋白酶（Dispase）混合物，用于原代细胞和干细胞的分离。

作为Biogradetech独家代理，艾美捷科技强烈推荐Biogradetech热销产品胶原酶，2 型。产品仅用于科研，不可用于临床诊断。

胶原酶，2 型试剂：

0.05 M TES [三(羟甲基)-甲基-2-氨基乙烷磺酸]缓冲液，含0.36 mM氯化钙，pH 7.5

4%甲基纤维素溶于7.1 mM氯化锡中

0.2 M柠檬酸钠，pH 5.0

硝基羟基吲哚-柠檬酸混合液：将50 ml含7.1 mM氯化锡的4%硝基羟基吲哚甲基纤维素与50 ml pH 5.0的0.2 M柠檬酸钠混合。让混合物搅拌5分钟。

50%正丙醇

底物：Worthington牛跟腱胶原（代码：CL）和无维生素酪蛋白

50%（重量/体积）三氯醋酸

酶：将酶以1 mg/ml的浓度溶解在含有0.36 mM氯化钙（pH 7.5）的0.05 M TES中。在上述缓冲液中，稀释液分别为1/10和1/20。

程序：

称取25 mg沃辛顿牛胶原蛋白，放入四个试管中。包括至少两个管作为不含酶的空白。向试管中加入5.0 ml 0.05 M TES缓冲液，并在37°C下孵育15分钟。在适当的试管中加入0.1毫升酶稀释液，开始反应。

5小时后，通过将0.2ml溶液（留下胶原）转移到含有1.0ml茚三酮-柠檬酸混合物的试管中来停止胶原酶反应。包括酶空白（用0.1ml TES缓冲液代替酶孵育的胶原）。在沸水浴中加热20分钟。冷却后，用5毫升50%正丙醇稀释。静置15分钟，读取600nm处的吸光度。从L-亮氨酸标准曲线确定相当于释放的亮氨酸的微摩尔氨基酸。

非特异性蛋白酶活性（即酪蛋白酶活性）使用上述测定法测定，并用25毫克不含维生素的酪蛋白代替胶原蛋白。5小时后通过加入0.5毫升50%三氯乙酸使反应停止。离心后，将0.2ml上清液转移到1.0ml茚三酮中，并如上处理。酪蛋白酶活性计算为胶原酶活性。

文献参考：

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An Editorial.

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Ashcroft, S. , Bassett, J. and Randle, P.

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Bagchi, N.

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Biogradetech成立于2015年，总部位于美国加利福尼亚州，早期以产品技术研发服务起家，逐步发展了广泛的产品线，并将其商业化销售，包括蛋白质、抗体、酶、培养基、试剂盒和仪器。适用于细胞生物学、蛋白质组学、分子生物学、免疫学、微生物学、诊断学、生物化学、神经科学、血液分析和高通量药物筛选等领域。