Biogradetech多色荧光标记技术：多重荧光免疫组化试剂盒-七色（100T）

多重荧光免疫组化试剂盒-七色（100T）主要用于组织的石蜡切片、TMA芯片的荧光法免疫组化染色。

作为Biogradetech独家代理，艾美捷科技强烈推荐Biogradetech热销产品多重荧光免疫组化试剂盒-七色（100T）。产品仅用于科研，不可用于临床诊断。

多重荧光免疫组化试剂盒-七色（100T）检测原理：

本试剂盒采用多标记免疫荧光染色技术，将抗原、抗体特异性结合的性质同酪胺信号放大技术相结合，选用辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗抗体，对试剂盒中的荧光染料进行活化，将信号共价结合到抗原上。借助于不同的荧光染料标记，通过多轮染色实现组织或细胞单个样本的原位多靶点染色。酪酰胺信号放大(TSA，Tyramide signal amplification)技术是一类利用辣根过氧化酶（HRP）对靶蛋白进行标记的酶学检测方法，类似常规免疫组化的 DAB 显色方法 ，TSA 技术同样采用 HRP 标记的二抗，同样有对应的“显色”步骤（HRP 催化加入反应体系的酪胺荧光素底物，产生活化荧光底物，活化底物可与抗原上的酪氨酸等残基共价结合，使样品上稳定的共价结合酪胺荧光素。之后用热修复法或者抗体洗脱液洗去非共价结合的一抗-二抗-HRP 复合物，重复下一种一抗-hrp 二抗来第二轮孵育，换另一种酪胺荧光素底物，如此往复就可实现多重标记。

TSA 详细原理是利用酪胺 Tyramide 的过氧化物酶反应（酪胺盐在 HRP 催化 H202 下形成共价键结合位点），产生大量的酶促产物，该产物能与周围的蛋白残基（包括色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基）结合，这样在抗原-抗体结合部位就有大量的荧光素沉积，结果使其检测信号得到 10-100 倍增强。简单来说，用这种方法做多重免疫荧光是利用二抗上带有的 HRP（而不是直接偶联荧光素），来催化后续添加入体系的非活性荧光素。荧光素在 HRP 和过氧化氢的作用下被活化，跟临近蛋白的酪氨酸残基共价偶联，使得蛋白样品与荧光素稳定结合。然后微波或煮沸或者水浴等热修复处理，前一轮非共价结合的抗体被洗掉，共价结合的荧光素稳定共价结合在样本切片蛋白上。再换个一抗来第二轮孵育，周而复始。等到所有抗体孵育结束，荧光素都结合好后，最后去检测结果。由于每次体系中都只有单一抗体孵育，因此无需担心抗体交叉反应，以及一抗二抗种属匹配问题，大大减少了实验设计时不同种属抗体选择匹配的限制。也就是说，如果用 TSA技术，同一张片子上所有的靶标都可以选用特异性高的兔单克隆抗体。搭配同一支抗兔的 HRP 二抗就可以进行实验，而且信号放大的倍数大大增强。

染料使用方法：

TSA 荧光染料工作液=Tyramide reagent + Tyramide Amplification Buffer ；

Tyramide reagent：Tyramide Amplification Buffer =1:100 ；

Tyramide reagent与 Tyramide Amplification Buffer 的稀释比例可以根据具体情况灵活调整优化，最佳范围为 1:50-1:200(1:100 大部分情况能得到最佳结果）；

一般建议若一抗孵育时间常温 1h-3h 内，建议稀释比例 1:50-1:200, 若一抗孵育时间 4 度过夜（12h 或以上），建议稀释比例 1:100-1:200 或更高。

存储条件

1. 试剂盒有效期为12个月，开封后有效期3个月，请尽快使用。

2. 2~8℃避光保存，使用前室温溶解并充分混匀。

3. 生产日期和失效日期见包装标签。

样本要求

1.福尔马林固定的组织蜡块或切片，大块组织或TMA均可。

2.样本需紧贴载玻片，无褶皱、破损、划伤或污渍。

3.样本应大于1000个细胞。

4.蜡块需包埋实体瘤组织。坏死瘤组织、细针穿刺物、细胞甩片样本会影响染色效果。

5.建议使用10%中性福尔马林固定组织，固定时间一般为18～24小时。

6.切片厚度为4um左右，请使用防脱载玻片。建议切片样本在制备后一周内进行多标记免疫荧光染

色。

7.石蜡切片样本制备过程不要添加任何粘合剂。样本应置于载玻片正面、中央位置。

设备耗材

1. 检验所需设备器材：荧光成像设备、通风橱、微量移液器、恒温干燥箱、微波炉、计时器等。

2. 检测所需耗材器皿：免疫组化笔、抗原修复盒、染色缸、孵育湿盒、盖玻片、洗瓶、量筒等。

试剂制备

1. 通用试剂：灭菌去离子水、二甲苯、乙醇（100%、95%、70%）、抗原修复液、封闭液、TBST等。

2. 通过将Tyramide Amplification Bufer Plus PartA和PartB两个组分等体积混合来制备1X的工作浓度缓冲液。为每个样品准备 100ul工作液。

3. 试剂配制：单色TSA荧光染料使用信号放大反应液1:100稀释制备工作液；DAPI使用无菌水1:100稀释制备工作液，

现用现配。

4. HRP标记二抗为工作液，直接使用，无需稀释。请注意试剂盒中二抗反应性要求，标配为HRP羊抗兔二抗。

技术要点

1. 与直接使用染料-二抗偶联物相比，使用Tyramide Amplification Kits 的免疫荧光成像通常显示出更高的灵敏度和

更强的信号。因此，可以使用较低浓度的一抗，以尽量减少来自非特异性结合的背景光。我们建议进行一抗滴定以找到最佳浓度

2. 如果担心背景荧光，我们建议并排运行未与一抗孵育的阴性对照。确保该阴性对照在孵育和洗涤期间不会被阳性样品中的试剂交叉污染。对于组织样本，我们还建议对未染色的对照(未添加抗体或酪胺)进行成像，以确定组织自发荧光对背景的影响。

3. 我们推荐使用5ug/mL 的 HRP 偶联物。 降低浓度可能会损害信号强度和灵敏度。

4. 我们建议Tyramide reagent 按 1:100稀释。更高的浓度除了可能得到更强的信号外，还可能导致更高的背景。可以通过滴定(从 1:50 到1:500)为您的特定应用找到最佳浓度。

5. 通过在每次酪胺反应后进行 HRP 淬灭或抗体剥离，可以依次使用多个Tyramide reagent 标记同一样品上的不同目标。共价连接到样品上的染料或生物素将保留。

6. 在进行链霉亲和素/生物素检测时，我们建议阻断样品中的内源性生物素以降低背景。

实验流程

操作步骤

1)脱蜡水合 

a)新鲜二甲苯浸片5min，重复3次。

b)梯度乙醇浸片：100% 5min；95% 5min；70% 5min。

c)灭菌水浸片1min，重复3次。

d)10%中性福尔马林浸片10min（防止脱片），灭菌水浸洗切片1min，重复3次。（可选）

e)1~3% H2O2室温孵育5~10min，以消除内源性过氧化物酶的活性。（可选）

f)灭菌水浸洗切片1min，重复3次。

2) 微波修复抗原 

a) 将脱蜡水合后的切片置于抗原修复盒中，加入足够的1×抗原修复液。

b) 将抗原修复盒置于微波炉内高火煮沸。

c) 低档火力维持10~15min（注意补充抗原修复液，防止蒸发过度导致干片）。

d) 取出抗原修复盒，自然冷却至室温。

3) 封闭 

a) 切片用1×TBST Buffer浸洗切片2min，重复3次。

b) 去除切片上残存洗液。

c) 用组化笔圈出玻片上的样本区域，滴加封闭液，覆盖样本区域。

d) 室温保湿轻微震荡10~30min。

4) 一抗孵育 

a) 去除切片上的封闭液。

b) 滴加适量的一抗溶液，浸没样本区域。

c) 室温保湿震荡孵育1h（需针对不同抗体做优化调整）。

d) 用1×TBST Buffer浸洗切片2min，重复3次。

5) 二抗孵育 

a) 去除切片上残存的洗液。

b) 直接滴加HRP标记二抗溶液，浸没样本区域。

c) 室温保湿震荡孵育10~30min。

d) 用1×TBST Buffer浸洗切片2min，重复3次。

6) 荧光染色放大信号

a) 去除切片上残存的洗液。

b) 滴加适量1×染料工作液（单色TSA荧光染料用信号放大液1:100稀释），浸没样本区域。

c) 室温保湿震荡孵育10~15min。

d) 用1×TBST Buffer浸洗切片2min，重复3次。

7) 微波修复降噪 

a) 按步骤2微波修复一次，室温自然冷却至室温。

b) 灭菌水洗片1次，1×TBST buffer浸片2min。

c) 单染结束，DAPI染色后封片观察或从步骤3（封闭）开始追加后续染色。

8) DAPI染色 

a) 去除切片上残存洗液，滴加DAPI工作液，室温保湿震荡孵育10~20min。

b) 1×TBST Buffer 浸洗切片，室温3min。

c) 灭菌水浸洗切片2min。

9) 封片观察 

a) 待切片微干，滴加增强型抗淬灭封片剂10~30μL。

b) 加盖玻片，密封剂（如指甲油）封边，防止样本干燥。

c) 阅片，对染色后的组织切片在荧光成像设备中采集图像、观察并进行判读。

结果判读

1. 微波修复抗原、孵育时间及温度的变化均有可能得出错误结果。

2. 在每次染色过程中，必须有阳性对照和阴性对照实验同时进行。

3. 若对照实验不能显示正确的染色，则应判定该批次样本的检测结果无效。

局限说明

1. 免疫组化染色过程中存在很多步骤或环节，每一个步骤或环节都可能影响到染色的最终结果。

2. 阳性信号定位不正确即为假阳性，包括着色不匀、背景着色、边缘效应，另外组织的某些特定成分也能导致假阳性。

3. 抗原修复方法不当或一抗效价降低、失效，均有可能导致假阴性结果。

4. 过度或不足的染色都可能影响结果的正确解释。

5. 本试剂盒只在10%中性福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片上进行了验证。

性能指标

1. 符合性：取符合性组织切片，经相应的免疫组化实验后，阳性对照染色结果为阳性，阴性对照染色结果为阴性。

2. 批内重复性：取同一批次的试剂盒，检测同一组织样本切片3片，染色结果一致。

注意事项

1. 本试剂盒只用于免疫组化，不做其它用途。

2. 本试剂盒仅限于专业人员使用。

3. 应采用适当的防护措施，以避免试剂同皮肤和眼睛接触。

4. 超过有效期的试剂活性可能降低，导致假阴性结果，因此不得使用超过有效期的试剂。

5. 若将本试剂盒的染色组分与其它公司的产品混合使用，在染色过程中可能出现异常情况。

6. 脱蜡不彻底，严重影响染色效果

7. 为了防止可能出现的假阴性、假阳性结果，实验过程中需有阳性对照及阴性对照同时进行。

8. 使用本试剂盒染色中所产生的各种废弃物都应按照《医疗废物管理条例》进行处理。

Biogradetech成立于2015年，总部位于美国加利福尼亚州，早期以产品技术研发服务起家，逐步发展了广泛的产品线，并将其商业化销售，包括蛋白质、抗体、酶、培养基、试剂盒和仪器。适用于细胞生物学、蛋白质组学、分子生物学、免疫学、微生物学、诊断学、生物化学、神经科学、血液分析和高通量药物筛选等领域。