超敏感OligoGreen ssDNA定量试剂盒推荐步骤

OligoGreen ssDNA定量试剂是一种超敏感的荧光核酸染料，用于定量溶液中的寡核苷酸和单链DNA（ssDNA）。短的合成寡核苷酸在许多分子生物学技术中被使用，如DNA测序、定点突变、DNA扩增和原位杂交。然而，传统的寡核苷酸定量方法不够敏感，通常需要高浓度的样品。目前特别常用的寡核苷酸和ssDNA浓度测量方法是通过测量在260 nm处的吸光度（A260）。吸光度法的主要缺点是核苷酸对信号的显著贡献、核酸制备中常见污染物的干扰以及测量的相对不敏感性（0.1 A260大约相当于3μg/mL的合成24碱基M13测序引物）。相比之下，

Biogradetech OliGreen ssDNA定量试剂可以使研究人员使用标准荧光分光光度计和荧光激发和发射波长将寡核苷酸或ssDNA定量至低至100 pg/mL（在2 mL检测体积中为200 pg）。这种敏感性比吸光度法高出10,000倍。使用荧光微孔板阅读器，我们可以检测到低至1 ng/mL（在200 μL检测体积中为200 pg）的寡核苷酸或ssDNA。

Biogradetech还使用OliGreen试剂定量了几个ssDNA样品，包括M13和fX174病毒DNA以及变性的牛胸腺DNA，并获得了类似的敏感性。OliGreen试剂可以检测到从100 pg/mL到1 μg/mL的寡核苷酸浓度范围。此外，Biogradetech已经证明，OliGreen试剂的线性在存在各种潜在化合物的情况下仍然稳健，包括盐、尿素、乙醇、氯仿、洗涤剂、蛋白质、ATP和琼脂糖；长度为六个碱基或更少的短寡核苷酸不会干扰定量测量。

艾美捷OligoGreen ssDNA定量试剂盒*2000次* 基本参数：

目录号：B-CHK002

规格：1mL

储存：在-20°C下储存

OligoGreen ssDNA定量试剂盒推荐的步骤：

该实验步骤适用于具有2 mL检测体积的标准荧光比色皿。如果在微孔板中进行分析，请相应调整所示的体积。例如，建议使用200 μL体积的96孔微孔板。

1. TE缓冲液的制备

准备TE稀释缓冲液，由10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、pH 7.5组成，用于稀释OliGreen试剂和寡核苷酸/ssDNA样品。由于OliGreen试剂是一种高灵敏度的ssDNA检测试剂，使用不含有核酸污染的TE溶液非常重要。OliGreen ssDNA定量试剂盒中包含的20倍浓缩TE缓冲液不含核酸酶和核酸。通过将浓缩缓冲液以20倍稀释在不含DNA酶的无菌蒸馏水中，制备1X TE工作液。

2. OliGreen工作液的制备

在实验开始前，通过将浓缩的DMSO溶液以200倍稀释在10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、pH 7.5（TE缓冲液）中，制备OliGreen试剂的水溶性工作液。例如，为了准备足够分析20个样品的工作液，将100 μL的OliGreen定量试剂加入19.9 mL的TE缓冲液中。建议使用塑料容器而不是玻璃容器来制备该溶液，因为试剂可能吸附在玻璃表面上。由于OliGreen试剂对光敏感，应通过用铝箔覆盖或存放在黑暗的地方来保护工作液。为了获得最佳结果，应在制备后几个小时内使用该溶液。

3.寡核苷酸标准品的制备

3.1在TE beffer中制备浓度为2μg/mL的寡核苷酸储备溶液。基于260nm处的吸光度，在具有1cm路径长度的比色皿中测量寡核苷酸的浓度（A260）。1.0的AnA260对应于寡核苷酸溶液的浓度为30-35μg/mL。

3.2对于高范围标准曲线，如表2所示，将2μg/mL寡核苷酸储备溶液稀释到一次性试管（或用于转移到石英试管的塑料管）中。然后将1.0 mL OliGreenreagent水溶液加入每个试管中。充分混合，在室温下孵育2-5分钟，避光3.3培养后，使用荧光分光光度计或荧光微板读取器在标准荧光波长（激发~480 nm，发射~520 nm）下测量样品的荧光。

3.4从每个样品的荧光值中减去空白的荧光值。使用校正的数据生成荧光与寡核苷酸浓度相关的标准曲线（图1）。3.5对于低范围标准曲线（从100 pg/mL到50 ng/mL），将100 ng/mL低聚核苷酸储备溶液（在步骤1.1中制备）稀释到一次性试管（或转移到石英试管的塑料管）中

4.样品分析

4.1在一次性试管中，将TE缓冲液中的实验寡核苷酸溶液稀释至1.0 mL的最终体积。您可能需要为多个实验样品准备稀释液。高度稀释样品有助于减少某些污染物的干扰。但是，避免使用极小的样品体积，因为它们很难准确地移液。

4.2向每个样品中加入1.0 mL OliGreen工作溶液。在室温下培养2-5分钟，避免暴露在光下。

4.3使用与生成标准曲线相对应的仪器参数测量样品的荧光（参见步骤3.3和3.5）。为了最大限度地减少光漂白效应，保持所有样品的荧光测量时间一致。

4.4从每个样品的荧光值中减去空白的荧光值。根据标准曲线测定寡核苷酸的浓度。

4.5使用不同稀释度的试剂重复测量样品，以确认定量结果。

文献参考：

1. Antisense Nucleic Acid Drug Dev 7,133（1997）; J Chromatogr A 755,271（1996）

该试剂仅用于科学研究领域，不适用于临床诊断或其他用途。

Biogradetech生命科学和医药研发行业关键原料与试剂的供应商：Biogradetech成立于2015年，总部位于美国加利福尼亚州，早期以产品技术研发服务起家，逐步发展了广泛的产品线，并将其商业化销售，包括蛋白质、抗体、酶、培养基、试剂盒和仪器。适用于细胞生物学、蛋白质组学、分子生物学、免疫学、微生物学、诊断学、生物化学、神经科学、血液分析和高通量药物筛选等领域。